液相色谱—串联质谱法测定猪肉中13种磺胺类药物残留
摘 要：利用液相色谱-电喷雾串联质谱建立猪肉中13种磺胺类药物残留的同时、快速分析方法。猪肉样品中的残留药物用1%乙酸-乙腈均质提取，浓缩后用0.1%甲酸-乙腈定容，并用正己烷液-液分配除脂后，用Kinetex C18色谱柱（100mm×2.1mm，2.6µm）分离，以0.1%甲酸-乙腈作为流动相梯度洗脱，采用电喷雾正离子电离，多反应监测模式检测，基质匹配外标法定量。13种磺胺类药物在1～300μg/kg范围内线性关系良好，定量限均小于10μg/kg。在1、2μg/kg和10μg/kg这3个添加水平下，回收率在60.0%～78.1%之间，相对标准偏差（RSD）在0.24%～8.88%之间。此方法操作简便，灵敏度、准确度、精密度均满足残留分析的要求。
关键词：猪肉；磺胺；液相色谱；质谱
Simultaneous Determination of Thirteen Sulfonamides in Meat using HPLC-MS/MS
ZHANG Zhi-gang
（State Key Laboratory of Food Safety Technology for Meat Products， Xiamen Yinxiang Group Co. Ltd.， Xiamen 361100， China）
Abstract：AHPLC-MS/MS method was developed for the simultaneous determination of thirteen sulfonamides in pork.The sulfonamide residues were extracted with acidic acetonitrile. The extract was concentrated and then defatted using hexane， filtered with 0.22 μm filter membrane and transferred into sample vial， ready for HPLC-MS/MS analysis. Chromatographic separation was performed on a Kinetex C18 （100×2.1 mm， 2.6 µm） column using a gradient elution with water （0.1% formic acid） and acetonitrile as mobile phases. Mass spectrometer was operated in multiple reaction monitoring of positive ionization mode. Thirteen sulfonamides showed good linearity between 1 and 300 μg/kg， and their limits of quantitation were all below 10μg/kg. The average recoveries at three spiked levels of 1μg/kg、2μg/kg and 10μg/kg ranged from 60% to 78.1% with relative standard deviations of 0.24%～8.88%. The method is simple， sensitive and selective， and applicable for the routine simultaneous determination of sulfonamides in meat.
Key words：meat；sulfonamides；liquid chromatography；mass spectrometry
中图分类号：O657 文献标志码：A 文章编号：
磺胺类药物（sulfonamides，SAs）是具有氨苯磺酰胺结构药物的总称，由于其具有高效、低毒、价格低廉等特点，作为广谱抑菌药在畜牧、水产等养殖生产中得到了广泛应用。随着我国居民生活水平的提高，猪肉的消费量增长很快，但是猪肉中SAs药物残留问题日益突出，引起了社会大众的广泛关注。SAs种类可达数千种，其中应用较广的就有几十种。通过任何途径摄入的SAs药物都会在人体中蓄积，对人体健康产生潜在的危害。SAs药物具有一定的副反应，比如导致过敏反应、造血紊乱、泌尿系统损害等等，而且某些SAs药物还具有潜在的致癌性。因此，世界各国都对此类药物在禽肉中的残留制定了严格的限量要求。美国规定磺胺氯哒嗪和磺胺甲氧哒嗪不得检出，其他SAs药物残留最大限量为0.1mg/kg；日本规定磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲嘧啶残留最大限量为0.02mg/kg，磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉残留最大限量为0.03mg/kg。欧盟和我国规定禽肉中SAs药物总量不得超过0.1mg/kg。
目前，禽肉中SAs的检测方法主要包括微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法（TLC）[1]、气相色谱/质谱法（GC/MS）[2]、高效液相色谱法（HPLC）[3-5]、毛细管电泳法（CE）[6]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）等。生物学方法虽然操作简单，但是难以对不同类别的SAs进行检测。GC-MS具有较高的灵敏度和特异性，但衍生化过程复杂。HPLC和CE的灵敏度低，选择性和特异性也不太理想，特别是在复杂基质中低浓度SAs测定时表现的非常明显。LC-MS/MS已经成为复杂基质中兽药残留的同时定性定量分析的主流方法，具有灵敏度高、选择性好、分析效率高等优点。LC-MS/MS已用于测定不同样品基质中的磺胺类药物[7-14]。本实验建立猪肉中13种常见SAs药物残留（磺胺甲噻二唑、磺胺异恶唑、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲恶唑）的分析方法，优化了提取条件和检测方法，回收率、定量限等参数完全能够满足现行标准法规的要求，为猪肉制品中SAs药物残留安全监测提供一个快速、灵敏、准确的检测手段。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
磺胺甲噻二唑、磺胺异恶唑、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲恶唑（纯度均>99%） 美国Sigma公司；甲醇、乙腈、正己烷为色谱纯试剂 德国Merck公司；其他试剂为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水为Mill-iQ高纯水。
1.2 仪器与设备
Agilent 1200高效液相色谱 美国安捷伦公司；API5000三重四极杆串联质谱仪（配有电喷雾离子源） 美国应用生物系统公司；TURRAX T25型均质器 德国IKA公司；Allegra 64R高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；全自动氮吹浓缩仪 美国Capiler Life Sciences公司；色谱柱 美国Phenomenex公司。
1.3 方法
1.3.1 标准储备液的配制和混合标准工作液的配制
准确称取适量标准品，分别用甲醇溶解并定容，配成质量浓度为100μg/mL的标准储备液，-18℃条件下避光保存。移取各标准储备溶液，用甲醇稀释成质量浓度为10μg/mL的混合标准中间溶液，-18℃条件下避光保存。根据需要用空白猪肉提取液逐级稀释配成适当浓度的混合标准工作液，现配现用。
1.3.2 液相色谱条件
Kinetex C18色谱柱（100mm×2.1mm，2.6µm）；流速0.3mL/min；柱温35℃；进样量5μL。梯度洗脱程序见表1。
表1 液相色谱梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution program of liquid chromatography
时间/min流动相A：0.1%甲酸水溶液/%流动相B：乙腈/%
09010
5.01090
8.01090
8.19010
10.09010
1.3.3 质谱条件
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5500V；离子源温度TEM：550℃；碰撞气CAD（N2）：4 psi；气帘气CUR（N2）：30 psi；GS1：50L/h；GS2：50L/h；驻留时间为20ms；入口电压EP：10V；监测离子对、去簇电压和碰撞能量详见表2。
表2 质谱参数
Table 2 Operating parameters of mass spectrometry
化合物母离子（m/z）子离子（m/z）去簇电压/V碰撞能量/eV
磺胺吡啶250.3156.2*
108.27723
37
磺胺嘧啶251.3156.2*
108.28923
32
磺胺噻唑256.3156.2*
108.29121
34
磺胺甲基嘧啶265.3156.2*
108.29023
34
磺胺异恶唑268.3156.2*
113.38019
24
磺胺甲噻二唑271.3156.2*
108.28021
35
磺胺二甲基嘧啶279.3186.2*
124.311026
36
磺胺氯哒嗪285.3156.2*
108.26222
37
磺胺喹恶啉301.4156.2*
108.210521
36
磺胺二甲氧嘧啶311.4156.2*
108.213027
40
磺胺醋酰215.2156.2*
108.27816
27
磺胺甲氧哒嗪281.3156.2*
108.214022
33
磺胺甲恶唑254.3156.2*
108.213022
32
注：*为定量离子。
1.3.4 样品处理
称取样品2g（精确至0.01g）于离心管中，加入4g无水硫酸钠，加入8mL 1%乙酸-乙腈，均质提取2min，以4000r/min离心4min，然后取上清液转移至20mL试管中，在45℃水浴下氮气吹干用1mL含有0.1%甲酸的乙腈定容，涡旋，再加入2mL正己烷除脂，涡旋。以15000r/min离心3min，经0.2μm有机相滤膜过滤，转移到进样瓶中，供液相色谱-串联质谱测定。
2 结果与分析
2.1 提取方法的优化
乙腈具有很强的组织渗透力，作为提取试剂在食品中磺胺类药物的分析中应用最为广泛。结果表明，乙腈对猪肉中各药物的提取回收率在51%～77%之间。考虑到磺胺类化合物均易溶于弱酸性溶液，因此选用1%乙酸-乙腈作为提取溶剂进行提取实验，表明该提取试剂不仅去除蛋白的效果好，而且容易浓缩，提取回收率也有所提高，可达60%～89%。因此在后续实验中均选择1%乙酸-乙腈作为提取溶剂。另外，在样品提取时加入无水硫酸钠可以有效地防止样品中的水分及干扰成分进入提取液，同时硫酸钠的存在可促使蛋白质的变性分散，防止样品结成块状影响提取。
2.2 质谱条件的优化
分别对100ng/mL各种药物的标准溶液进行母离子全扫描，确定其分子离子，并优化各分子离子的去簇电压。然后分别以上述离子为母离子，对其子离子进行全扫描，选择丰度较高、干扰较小的两对子离子为定性离子，峰度最高的作为定量离子，然后优化其碰撞能量（优化后的质谱条件见表2），使得分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳。图1、2显示了13种磺胺类药物在优化条件下的TIC图和MRM色谱图。
图1 13种磺胺类药物的TIC图
Fig.1 TIC chromatograms of meat spiked with 13 sulfonamides
a.磺胺吡啶；b.磺胺嘧啶；c.磺胺噻唑；d.磺胺甲基嘧啶；e.磺胺异恶唑；f.磺胺甲噻二唑；g.磺胺二甲基嘧啶；h.磺胺氯哒嗪；i.磺胺喹恶啉；j.磺胺二甲氧嘧啶；k.磺胺醋酰；l.磺胺甲氧哒嗪；m.磺胺甲恶唑。
图2 13种磺胺类药物的MRM色谱图
Fig.2 MRM chromatograms of meat spiked with 13 sulfonamides
2.3 线性范围和定量限
取一系列混合药物标准工作溶液（1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、300.0ng/mL），以峰面积Y和对应的质量浓度X（ng/mL）作图，如表3所示，在1～300ng/mL范围内，各药物质量浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系，相关系数大于0.99。磺胺药物的定量限如表3所示，均小于10μg/kg，远远低于欧美日等国家设定的残留最大限量，说明该方法的灵敏度完全适合日常分析的要求。
表3 13种磺胺类药物的线性方程、相关系数、回收率和定量限
Table 3 Linear equation， correlation coefficient， recovery and limit of quantification of 13 sulfonamides
药物线性方程相关系数回收率/%定量限/
（μg/kg）
1μg/kg2μg/kg10μg/kg
磺胺吡啶Y=4235X+36000.999262.962.861.18
磺胺嘧啶Y=3154X+78900.998968.463.876.45
磺胺噻唑Y=2120X+28900.999466.273.462.35
磺胺甲基嘧啶Y=3182X+21100.999064.169.762.65
磺胺异恶唑Y=5390X+40900.998861.163.569.18
磺胺甲噻二唑Y= 2605X+28900.999663.867.167.64
磺胺二甲基嘧啶Y=2980X+21000.999169.272.878.14
磺胺氯哒嗪Y= 2210X+31300.998862.862.166.35
磺胺喹恶啉Y=2900X+28900.999960.060.765.65
磺胺二甲氧嘧啶Y=956X-22800.999565.961.264.14
磺胺醋酰Y=9990X+12300.999360.461.868.18
磺胺甲氧哒嗪Y=3670X+69200.999269.677.265.75
磺胺甲恶唑Y=3715X+42100.999663.173.166.45
2.4 回收率和精密度
用空白猪肉样品进行添加回收率和精密度实验，样品添加不同浓度的标准品后匀浆，放置过夜，使标准品在样品中实现充分的交换平衡，然后按上述方法进行提取、净化和液相色谱-串联四极杆质谱测定，其回收率和精密度结果见表3。在添加水平1、2μg/kg和10μg/kg时，其回收率在60.0%～78.1%之间，相对标准偏差（RSD）在0.24%～8.88%，说明该方法具有很好的回收率和重现性。
3 结 论
所发展的液相色谱/串联质谱方法可在10min内完成13种磺胺类药物残留的定量和确证性分析，结合液液萃取和高选择性的MRM模式，很好地实现了样品与杂质的分离，省去了固相萃取步骤，大大提高了分析效率。前处理步骤简单快速，重复性好。13种磺胺类药物具有很宽的线性范围，回收率在60%～78.1%，定量限均小于10μg/kg，远低于欧美日设定的残留最大限量。此方法操作简便，灵敏度、准确度、精密度均满足残留分析的要求，完全可满足国内外对猪肉中磺胺类化合物的快速、准确的检测要求。
参考文献：
[1] AOAC Official Method 983.31， Sulfonamide Residues in Animal Tissues Thinlayer Chromatographic Screening Methods[S]. 1984.
[2] REEVES V B. Confirmation of multiple sulfonamide residues in bovine milk by gas chromatography-positive chemical ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B： Biomedical Sciences and Applications， 1999， 723（1/2）： 127-137.
[3] PECORELLI I， BIBI R， FIORONI L， et al. Validation of a confirmatory method for the determination of sulphonamides in muscle according to the European Union regulation 2002/657/EC[J]. Journal of Chromatography A， 2004， 1032： 23-29.
[4] HELA W， BRANDTNER M， WIDEK R， et al. Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC-DAD for detection[J]. Food Chemistry， 2003， 83（4）： 601-608.
[5]潘葳， 饶秋华， 苏德森. 鳗鱼中五种磺胺类药物残留的测定[J]. 色谱， 2004， 22（2）： 186.
[6] FUH M R S， CHU Suyi. Quantitative determination of sulfonamide in meat by solid-phase extraction and capillary electrophoresis[J]. Analytica Chimica Acta， 2003， 499： 215-221.
[7] CAVALIERE C， CURINI R， Di CORCIA A， et al. A simple and sensitive liquid chromatography-mass spectrometry confirmatory method for analyzing sulfonamide antibacterials in milk and egg[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51（3）： 558-566.
[8]庞国芳， 曹彦忠， 张进杰， 等. 液相色谱-串联质谱同时测定家禽组织中16种磺胺残留[J].分析化学， 2005， 33（9）： 1252-1256.
[9]董丹， 邵兵， 吴永宁， 等. 液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法测定鸡肉中17种磺胺类药物的残留[J]. 色谱， 2005， 23（4）： 404-407.
[10] 晏利芝， 赵永彪， 富玉， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定猪肉中受体激动剂、喹诺酮类和磺胺类兽药残留量[J]. 分析试验室， 2011， 30（1）： 84-86.
[11] 刘佳佳， 佘永新， 刘洪斌， 等. 高效液相色谱串联质谱法同时测定动物源性食品中24种磺胺类药物残留[J]. 分析试验室， 2011， 30（2）： 9-13.
[12] 佘永新， 刘佳佳， 王静， 等. 超高压液相色谱-串联四极杆质谱法对牛奶中24种磺胺类药物残留的检测[J]. 分析测试学报， 2008， 27（12）： 1313-1317.
[13] 陈坤才， 刘莉治， 彭荣飞， 等. 电喷雾超高效液质联用法测定动物性食品中磺胺类药残留[J]. 中国卫生检验杂志， 2012， 22（9）： 2034-2036； 2040.
[14] 孙伟红， 冷凯良， 王志杰， 等. HPLC-MS/MS内标法同时测定水产品中18种磺胺类药物残留量[J]. 食品科学， 2008， 29（24）： 294-298.