超高效液相色谱—串联质谱法测定去氢骆驼蓬碱衍生物DH—330血药浓度及其在大鼠体内的药动学评价
中图分类号 R969.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）12-1590-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.12.02
摘 要 目的：建立大鼠血浆中去氢骆驼蓬碱衍生物DH-330的测定方法，并对大鼠灌胃DH-330后的药动学行为进行评价。方法：以替硝唑为内标，血浆样品以乙腈沉淀蛋白处理后，采用超高效液相色谱-串联质谱法测定血药浓度。色谱分析采用色谱柱为Waters ACQUITY BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-甲醇-0.5%甲酸水溶液（15 ∶ 55 ∶ 30，V/V/V），流速为0.4 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为5 μL；质谱分析采用电喷雾电离源，正离子扫描，离子源温度为124 ℃，DH-330检测质荷比（m/z）为335.8→334.8，内标m/z为247.0→81.0。取6 只Wistar大鼠，灌胃DH-330混悬液（50 mg/kg），分别于给药前（0 h）及给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h时于大鼠眼底靜脉丛采血，测定DH-330血药浓度并绘制血药浓度-时间曲线，并采用Kinetica 5.0软件计算其药动学参数。结果：DH-330血药浓度的线性范围为25.05～2 004 ng/mL（r=0.999 8），定量下限为25.05 ng/mL；日内、日间精密度RSD均小于10%；准确度相对误差（RE）为-9.76%～4.55%，提取回收率大于85%（RSD<5%）；稳定性RE为-2.53%～2.29%；不受基质效应或进样残留效应的影响。大鼠灌胃DH-330后达峰浓度为（1 162.43±241.72）ng/mL，药-时曲线下面积为（3 242.93±652.31）ng·h/mL，半衰期为（1.93±0.61）h，平均滞留时间为（3.23±0.30）h，清除率为（16.80±5.30）L/（h·kg），稳态表观分布容积为（54.78±19.64）L/kg。结论：本研究建立的方法具有操作简便，专属性强，灵敏度、精密度及回收率高等优点，可用于大鼠血浆中DH-330血药浓度的测定。大鼠灌胃给药后，DH-330的半衰期短，吸收迅速，表观分布容积大，表明其具有高的亲脂性，可能主要集中分布于组织中。
关键词 去氢骆驼蓬碱衍生物；DH-330；超高效液相色谱-串联质谱法；血药浓度；药动学；大鼠
Determination of Plasma Concentration of Harmine Derivative DH-330 by UPLC-MS and Its Pharma- cokinetics Evaluation in Rats
GAO Huijing1，Arslan·Ahmat2，XU Zhaohui3，FAN Wenxi3，CHEN Guoru4，ZHAO Jun1（1. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China；2. Xinjiang Institute for Food and Drug Control， Urumqi 830002， China； 3. Xinjiang Huashidan Pharmaceutical Co.， Ltd.， Urumqi 830011， China； 4. College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of harmine derivative DH-330 in rat plasma and to use it for pharmacokinetic behavior evaluation of DH-330 in rats after intragastric administration. METHODS： Using tinidazole as internal standard， after pre-treatment of acetonitrile precipitated protein， UPLC-MS method was adopted to determine the plasma concentration of DH-330. UPLC analysis was performed on Waters ACQUITY BEH C18 column （50 mm×2.1 mm，1.7 μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-methanol-0.5% formic acid aqueous solution（15 ∶ 55 ∶ 30， V/V/V） at flow rate of 0.4 mL/min， while the column temperature was 30 ℃， and sample size was 5 μL. MS analysis was conducted by electrospray ionization source， positive ion scanning， ion source temperature at 124 ℃， DH-330 detection of mass to charge ratio （m/z） of 335.8→334.8， and internal standard m/z of 247.0→81.0. Six Wistar rats were given DH-330 suspension（50 mg/kg） intragastrically. Blood samples were collected from fundus venous plexus capillary before administration （0 h） and 0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24 h after administration. Plasma concentration of DH-330 was determined and plasma concentration-time curves were drawn. Pharmacokinetic parameters were calculated by using Kinetica 5.0 software. RESULTS： The linear ranges of DH-330 were 25.05-2 004 ng/mL（r=0.999 8），and the limits of quantitation was 25.05 ng/mL. RSDs of intra-day and inter-day were all less than 10%. The accuracy RE was -9.76% to 4.55%. The extraction recovery was higher than 85%（RSD<5%）. Stability RE was -2.53% to 2.29%. They were not affected by matrix effect or residual effect of injection. The pharmacokinetic parameters of DH-330 in rats after intragastric administration included that cmax was （1 162.43±241.72）ng/mL，AUC0-∞ was （3 242.93±652.31）ng·h/mL，t1/2 was （1.93±0.61）h， MRT was （3.23±0.30）h，CL was （16.80±5.30）L/h·kg， Vss was （54.78±19.64）L/kg. CONCLUSIONS： The established method is simple， specific， sensitive， precise and recovery， which can be used for the plasma concentration determination of DH-330 in rats. DH-330 has short half-life， rapid absorption and large apparent distribution volume after intragastric administration in rats， which indicates that it has high lipophilicity and may be mainly distributed in tissues.
KEYWORDS Harmine derivative； DH-330； UPLC-MS； Plasma concentration； Pharmacokinetics； Rats
骆驼蓬（Peganum harmala L.）系蒺藜科多年生草本植物，在我国主要分布于西北部的新疆、甘肃、内蒙古、宁夏等干旱地区[1]，是我国维吾尔族、蒙古族、哈萨克族等民族沿用已久的民族药，已被列入维吾尔药卫生部药品标准。骆驼蓬的药用部位主要是其种子，即骆驼蓬籽。骆驼蓬籽中含有大量生物碱，其中主要为骆驼蓬碱（Harmaline）和去氢骆驼蓬碱（Harmine）[2]。
骆驼蓬生物碱和去氢骆驼蓬生物碱具有广泛的药理作用，如抗炎、镇痛、止痒、调节免疫、抗银屑病[3]、抗包虫[4]、抗肿瘤[5-6]等，但由于其具有明显的神经毒性而未能成功开发并应用于臨床。为此，本课题组对去氢骆驼蓬碱的β-咔啉环上第9位进行了结构改造，合成了无神经毒性并具有较高抗肿瘤活性的去氢骆驼蓬碱衍生物DH-330[7]，其药动学行为是影响其能否开发成新药的重要因素之一。
超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）联用技术集液相色谱法的高分辨能力和质谱法的高灵敏度、高选择性于一体，近年来被广泛应用于医药领域，包括药物及其代谢产物分析、天然产物化学成分分析等方面[8]，而且无需复杂的样品处理过程，在药动学研究中发挥了很大作用[9]。基于此，本研究采用UPLC-MS联用技术建立了一种简便、快速的测定大鼠血浆中DH-330浓度的方法，并对该衍生物在大鼠体内的药动学特征进行研究，旨在为DH-330的开发和应用以及下一步其体内代谢物的研究提供实验基础。
1 材料
1.1 仪器
ACQUITY H-Class型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；FJY1002-UVF基因研究型超纯水机（青岛富勒姆科技有限公司）；BP211D型十万分之一天平（德国Sartorius公司）；DS-671型电子天平（上海寺冈电子有限公司）；KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；IKA MS3型数显涡旋振荡器（德国IKA公司）；HC-2518型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；BYN100-1型氮吹仪（上海秉越电子仪器有限公司）。
1.2 药品与试剂
DH-330原料药（新疆华世丹药业股份有限公司，批号：170815，纯度：98%）；替硝唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100336-201704，纯度：>98%）；聚山梨酯80（湖南尔康制药有限公司，批号：20100801）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，天津市光复精细化工研究所，批号：20100409）；无水甲酸、甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。
1.3 动物
清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量为（200±20）g，由新疆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产合格证号：SYXK（新）2016-0004。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 DH-330混悬液 精密称取DH-330原料药80.00 mg，置于10 mL离心管中，加20%聚山梨酯80溶液适量使药物完全润湿，涡旋混匀，然后再加入0.5%CMC-Na溶液定容至8 mL，配制成质量浓度为10 mg/mL的DH-330混悬液。
2.1.2 DH-330工作溶液 精密称取DH-330原料药25.05 mg，加甲醇溶解并定容至25 mL，配制成质量浓度为1.002 mg/mL的DH-330贮备液；精密吸取该贮备液适量，加甲醇稀释配成质量浓度为10.02 μg/mL的DH-330工作溶液。
2.1.3 内标溶液 精密称取替硝唑对照品10.20 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为1.02 mg/mL的内标贮备液；精密吸取该贮备液适量，加甲醇稀释配成质量浓度为2.04 μg/mL的内标溶液，置于4 ℃冰箱中保存，备用。
2.2 血浆样品的预处理
在离心管中加入内标溶液25 μL，40 ℃下氮气吹干，加入血浆样品100 μL，超声（功率：200 W，频率：80 kHz）5 min，涡旋震荡30 s后，加入乙腈200 μL，涡旋震荡3 min，以12 000 r/min离心10 min，取上清液进样分析。
2.3 色谱条件与质谱条件
2.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.5%甲酸水溶液（15 ∶ 55 ∶ 30，V/V/V）；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃。
2.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子模式；锥孔电压：15 V；毛细管电压：0.8 kV；离子源温度：124 ℃；DH-330检测质荷比（m/z）为335.8→334.8，替硝唑m/z为247.0→81.0。
2.4 方法学考察
2.4.1 专属性 分别取大鼠空白血浆、空白血浆+DH- 330对照品、大鼠灌胃给药后2 h后的血浆样品，按照“2.2”项下方法预处理，再按“2.3”项下色谱与质谱条件进样分析，记录色谱图，详见图1。结果显示，DH-330和内标（替硝唑）的保留时间分别为4.25、1.70 min，峰形良好，血浆中的内源性物质对待测物的测定无干扰，表明所建方法专属性良好。
2.4.2 线性范围、定量下限与检测限考察 取“2.1.2”项下DH-330工作溶液，以甲醇稀释制成质量浓度分别为100.2、200.4、601.2、1 202.4、3 006、4 008、8 016 ng/mL的系列DH-330对照品溶液。精密吸取上述系列DH-330对照品溶液和内标溶液各25 μL，40 ℃下氮气吹干后，分别加入大鼠空白血浆100 μL，制成质量浓度为25.05、50.1、150.3、300.6、751.5、1 002、2 004 ng/mL的DH-330血浆样品，分别按“2.2”项下方法预处理后，再按“2.3”项下色谱与质谱条件进样分析，记录峰面积。以DH-330血药浓度（x，ng/mL）为横坐标、DH-330峰面积与内标峰面积比值（y）为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程为y=0.002x-0.037（r=0.999 8）。另同法配制质量浓度为25.05 ng/mL 的DH-330血浆样品，平行操作5次，同法预处理后进样测定，结果RSD为8.21%（n=5）。这表明，DH-330血药浓度在25.05～2 004 ng/mL范围内线性关系良好，定量下限（LLOQ）为25.05 ng/mL。另取质量浓度为25.05 ng/mL的DH-330血浆样品，以流动相倍比稀释，同法预处理后进样测定，以信噪比为3 ∶ 1求得DH-330的检测限（LOD）为5 ng/mL。
2.4.3 精密度和准确度 按“2.4.2”项下方法配制低、中、高质量浓度（50、500、2 000 ng/mL）的DH-330质控样品，平行操作5次，分别按“2.2”项下方法预处理后进样测定，考察日内精密度；各质量浓度的5份平行样品连续测定5 d，考察日间精密度。同时，以DH-330峰面积和内标峰面积的比值代入随行标准曲线计算实测浓度，与理论浓度相比较，以相对误差（RE）来表示方法准确度[RE=（实测质量浓度-理论质量浓度）/理论质量浓度×100%]。结果显示，DH-330日内、日间精密度试验的RSD和准确度RE绝对值均小于10%，均符合生物样品定量分析的相关要求[10]，详见表1。
2.4.4 提取回收率 按“2.4.3”项下方法配制低、中、高质量浓度（50、500、2 000 ng/mL）的DH-330血浆样品，平行操作5次，分别按“2.2”项下方法预处理后进样测定；另取乙腈沉淀蛋白后的空白血浆，加入DH-330工作溶液适量，并以乙腈稀释配制成与样品相同浓度的对照溶液，进样分析。将上述血浆样品与对照溶液分别测得的DH-330峰面积进行比较，计算提取回收率。结果显示，各质量浓度样品中DH-330的提取回收率均大于85%，详见表2。
2.4.6 基质效应 分别取6只大鼠空白血浆各100 μL，按“2.2”项下方法预处理后，加入DH-330工作溶液适量，配制成低、中、高质量浓度（50、500、2 000 ng/mL）的基质效应样品，进样分析，记录峰面积（A1）；另取DH-330工作溶液，用甲醇稀释配制成对应浓度的基质效应对照溶液，进样分析，记录峰面积（A2）。各平行操作3次，并按公式计算基质效应因子（MF）：MF=A1/A2×100%。另同法操作，测得内标的MF值。然后以DH-330与内标的MF比值计算得内标归一化基质效应因子为（98.64±3.15）%，RSD为3.19%（n=3）。结果表明，在本方法的色谱与质谱条件下，可忽略基质效应的影响[10]。
2.4.7 进样残留效应 按“2.4.2”项下方法配制质量浓度为2 000 ng/mL的DH-330质控样品，按“2.2”项下方法预处理后进样测定；随后进样空白血浆预处理后的样品液，平行操作3次。将空白血浆样品色谱中DH-330残留峰面积分别与“2.4.2”项下LLOQ样品所得色谱中的DH-330峰面积、内标峰面积进行比较，考察进样残留效应。结果显示，空白血浆样品的DH-330残留峰面积为LLOQ样品中DH-330峰面积的5.43%（小于LLOQ样品主峰面积的20%），为LLOQ样品中内标峰面积的0.81%（小于LLOQ样品内标峰面积的5%），表明血浆中DH-330的测定无进样残留效应[10]，详见表4。
2.5 药动学研究
取大鼠6只，适应性喂养1周后，禁食不禁水12 h，分别灌胃“2.1.1”项下DH-330混悬液（50 mg/kg，剂量根据本课题组前期药效学研究结果制定）。分別于给药前（0 h）及给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h时于大鼠眼底静脉丛采血0.4 mL，置于肝素钠抗凝的离心管中，以3 500 r/min离心15 min，分离上层血浆，于-35 ℃保存，备测。
取大鼠血浆，按“2.2”项下方法预处理后，再按“2.3”项下色谱与质谱条件进样测定，代入随行标准曲线计算DH-330血药浓度，并绘制其平均血药浓度-时间曲线，详见图2。应用Kinetica 5.0药动学软件对所测数据进行非房室模型拟合并计算药动学参数，详见表5。
由表5可见，大鼠灌胃给予DH-330混悬液后，在1 h内血药浓度即达到峰浓度（1 162.43±241.72）ng/mL，然后被快速消除，t1/2为（1.93±0.61）h，CL为（16.80±5.30）L/（h·kg），表明DH-330在血浆中清除速度较快；MRT为（3.23±0.30）h，即DH-330从体内消除63.2%时需要3.23 h；Vss为（54.78±19.64）L/kg，大于大鼠体液总体积（约0.7 L/kg[11]），表明DH-330血浆药物浓度相对较低，具有较高的组织亲和力，这一特点可能与其高度亲脂性有关。
3 讨论
去氢骆驼蓬碱具有广泛的药理作用，学者们对其药效学、药动学、制剂学进行了大量研究[12-15]，但未能实现其开发及临床应用，其根本原因是由于该生物碱具有较大的神经毒性，人或动物大量给药后会出现震颤、运动失调、呕吐等神经中毒症状，以及体温升高和心血管系统紊乱等[13]。由于β-咔啉类生物碱的结构与1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP，强黑质毒素，可诱发帕金森病）[16]相似，因此这类化合物可能具有类似的内源性神经毒素的毒性作用。
为降低去氢骆驼蓬碱的毒性作用，学者们致力于改造其化学结构[17-18]，获得大量候选化合物，然后再通过体内外药效学、药动学等研究筛选出目标化合物。其中，药动学在新药开发过程中发挥着重要的作用。药动学性质不理想可造成药物缺乏体内活性，如首关消除较强或难以通过肠黏膜被吸收，生物利用度太低；或代谢太快，半衰期太短；或难以通过生物膜，从而使药物难以进入靶器官等。据文献报道，约有40%的候选化合物是由于药动学方面的原因而被淘汰的[19]。因此，本实验进行了去氢骆驼蓬碱衍生物DH-330在大鼠体内的药动学研究，可为其后续开发和应用以及下一步其体内代谢物的研究提供参考。
为准确检测大鼠血浆中DH-330的质量浓度，本研究在预试验中考察了不同的流动相体系、流速、柱温、锥孔电压、毛细管电压等因素对其定量分析的影响。结果发现，当流动相为甲醇-乙腈-甲酸（55 ∶ 15 ∶ 30，V/V/V）、流速为0.4 mL/min、锥孔电压为15 V、毛细管电压为0.8 kV时，DH-330的保留时间合适、峰形较好，且不受内源性物质的干扰，故选择该条件为最终测定条件。方法学考察结果显示，本研究建立的UPLC-MS方法具有操作简便，专属性强，灵敏度、精密度及回收率高等优点，可用于大鼠血浆中DH-330血药浓度的测定。
在体药动学研究结果显示，对大鼠灌胃给予DH- 330后，其半衰期短、吸收迅速、表观分布容积大（大于体液体积0.7 L/kg），表明其具有高的亲脂性，可能主要集中分布于组织中。但DH-330在组织中具体如何分布，有待于进一步研究证实。
参考文献
[ 1 ] 宋红健.天然产物骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱及其衍生物的合成、生物活性和构效关系研究[D].天津：南开大学，2014.
[ 2 ] 史小媛，刘伟，张磊，等.骆驼蓬总生物碱中骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱及其代谢产物大鼠体内药代动力学研究[J].中成药，2014，36（6）：1169-1175.
[ 3 ] 张义英，王俊儒，李越鲲，等.骆驼蓬生物碱生物活性的研究进展[J].动物医学进展，2006，27（10）：37-40
[ 4 ] 李红玲，赵军，马运芳，等.去氢骆驼蓬碱抗细粒棘球蚴原头节作用研究[J].中国病原生物学杂志，2014，9（11）：995-999.
[ 5 ] 李船.去氢骆驼蓬碱诱导人胃癌细胞MGC-803及SGC- 7901自噬及凋亡的机制研究[D].广州：广东药科大学，2017.
[ 6 ] GENG XR，REN YC，WANG FF，et al. Harmines inhibit cancer cell growth through coordinated activation of apoptosis and inhibition of autophagy[J]. Biochem Biophys Res Commun，2018，498（1）：99-104.
[ 7 ] 郭亮，孙洁，范文玺，等.去氢骆驼蓬碱衍生物的合成和抗肿瘤活性研究[J].中国现代应用药学，2012，29（5）：385-388.
[ 8 ] 贺平. LC/MS方法检测大鼠血浆中黄连素和酮康唑及药代动力学应用[D].天津：天津医科大学，2015.
[ 9 ] 刘祥东，梁琼麟，罗国安，等.液质联用技术在医药领域中的应用[J].药物分析杂志，2005，25（1）：110-116.
[10] 國家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：通则363-364.
[11] 爱德华·克恩斯，邸力.类药性质：概念、结构设计与方法：从ADME到安全性优化[M].钟大放，译.北京：科学出版社，2010：216.
[12] 王长虹，孙殿甲，高炜玮.大鼠静脉注射和灌胃盐酸去氢骆驼蓬碱的药物动力学[J].中国临床药学杂志，2002，11（3）：159-161.
[13] 岳佳琪.去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱在羊体内外代谢与药代动力学研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2016.
[14] 马亭云，姜继宗，张刘红，等.去氢骆驼蓬碱醇质体的制备及处方优化[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（8）：34- 39.
[15] 丁志荣，滕亮，戴秀勇，等.盐酸去氢骆驼蓬碱乳膏处方筛选及其止痒药效学研究[J].中成药，2010，32（5）：753- 757.
[16] FRISON G，FAVRETTO D，ZANCANARO F，et al. A case of β-carboline alkaloid intoxication following ingestion of Peganum harmala seed extract[J]. Forensic Sci Int，2008，179（2）：37-43.
[17] 曹日晖，武嘉林，于富生，等.去氢骆驼蓬碱衍生类化合物及其应用，中国：CN200710180027.3[P].2004-12-08.
[18] 顾月清，王阿琴，陈玉祺.具有靶向特性的去氢骆驼蓬碱衍生物的抗肿瘤前药，中国：CN201210521152.7[P].2013-
03-20.
[19] 颜锐思.大鼠体内（3aRS，4S，7R，7aS）-4，7-环氧六氢-2-（三环[3.3.1.13，7癸烷）-1H-异吲哚-1，3（2H）-二酮（SU2162）药物动力学及组织分布研究[D].广州：广东药学院，2015.
（收稿日期：2018-10-23 修回日期：2019-04-23）
（编辑：段思怡）