三七总皂苷通过调节Caspase-3,、Caspase-9的表达诱导肝癌细胞BEL-7404凋亡的研究
【摘要】 目的 观察三七总皂苷（PNS）对肝癌细胞 BEL-7404 细胞线粒体膜电位、凋亡、Caspase-3、Caspase-9表达的影响，并探讨其诱导肝癌细胞BEL-7404 凋亡的机制。方法 将BEL-7404细胞分为：对照组、模型组、PNS组。对照组不加药物培养，模型组加阿霉素（10 μg/mL）培养，PNS 组用不同浓度 PNS 作用于BEL-7404 细胞。CCK-8测定细胞抑制率、流式细胞术检测凋亡、线粒体膜电位，ELISA法检测 Caspase-3、Caspase-9表达。结果 不同浓度的PNS均可降低BEL-7404细胞线粒体膜电位，100 μg/mL的PNS作用肝癌细胞48 h后，细胞线粒体膜电位较对照组降低 （P<0.01），随着PNS浓度的增大，细胞凋亡率较对照组升高 （P<0.01）。与对照组比较，PNS 对BEL-7404细胞Caspase-3、Caspase-9的表达均有不同程度的增加。20 μg/mL的PNS作用于BEL-7404细胞48 h后，Caspase-9的表达量较对照组上升（P<0.05）;40 μg/mL的PNS作用于BEL-7404细胞48 h后Caspase-3的表达量较对照组上升（P<0.05）。结论 一定剂量的三七总皂苷能降低BEL-7404细胞线粒体膜电位，可能是活化Caspase-9后激活凋亡因子caspase-3而导致细胞凋亡。
【关键词】 三七总皂苷;线粒体膜电位;肝癌细胞;凋亡;Caspase-3;Caspase-9
中图分类号：R735.7 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.06.001
三七总皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是从五加科人参属多年生草本植物三七中提取的主要有效成分，有活血祛瘀、活络通脉等功效。国内外科学家对三七的药理作用进行了广泛研究，发表了大量的研究报告，揭示了三七在血液系統、心血管系统、神经系统、免疫系统、代谢系统以及抗炎、抗衰老等方面的生理活性。国内有研究指出[1～3]，中药三七有诱导癌细胞凋亡的作用，但在抗肿瘤方面的实验研究还没有得到广泛的开展，其诱导肿瘤细胞凋亡的途径和靶点仍缺乏深入研究。本实验以体外培养的细胞株BEL-7404人肝癌细胞为研究对象，探讨不同浓度的 PNS作用于人肝癌细胞株后，通过对线粒体膜电位及Caspase-9、Caspase-3相关活化因子的影响探索其诱导细胞凋亡的作用机制。
1 实验材料与方法
1.1 药物及材料
人肝癌细胞株BEL-7404细胞（上海细胞库提供）;1640培养基购自 Gibco 公司;胎牛血清购自Gibco 公司;二甲基亚砜（DMSO）购自 Sigma 公司;线粒体膜电位检测试剂盒、凋亡试剂盒购自BD公司;Caspase-3、Caspase-9 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司;CCK-8试剂盒购自日本同仁公司。
1.2 仪器设备
流式细胞仪（美国贝克曼，CytoFlex）、低温高速离心机（德国eppendorf）、生物安全柜（博讯）、CO2培养箱（赛默飞）、酶标仪（赛默飞）。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养及处理
人肝癌细胞BEL-7404贴壁生长于PRMI-1640培养液中，其内包含有 100 U/mL链霉素，100 U/mL青霉素，浓度为10%胎牛血清。3～4天传代换液一次。冻存：取对数生长期细胞，0.25%的胰酶消化制成细胞悬液，移至离心管，1000 rpm离心10 min，弃上清，加入1 mL冻存液，用吸管吹打均匀制成细胞悬液，细胞浓度为106个/mL。转入到冻存管，置液氮中保存。复苏：液氮中取出的冻存管，1分钟内使其溶化，将细胞悬液移入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃上清，沉淀加5 mL培养液，吹打、离心、弃上清。加入 10 mL 全培养基重悬，轻微吹打均匀，将细胞悬液移入培养瓶中，置于5% CO2培养箱培养。
1.3.2 实验分组
①对照组：包含有细胞的培养基、无药物;②细胞阳模组：包含有细胞的培养基、加阿霉素（10 μg/mL）;③PNS组：选择 PNS标准品（由广西中医药大学第一附属医院医学分子生物学实验室统一购买），参阅相关文献及预实验结果，选择PNS的终浓度为 20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL。
1.3.3 细胞生长抑制率测定
取对数生长期细胞BEL-7404，待细胞贴壁率达到90%以上时，胰酶消化，制成细胞悬液，再将细胞悬液转入离心管中，1000 rpm/min 离心5 min。弃去上清液，加入适量含 10%胎牛血清的1640培养液，计数板计数细胞，将 1.0×104个/mL细胞加入96孔培养板中，每孔200 μL，培养24 h，待细胞贴壁后，按实验分组加药，每孔终体积为200 μL，继续培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL反应，继续培养4 h，用酶标仪在波长450 nm处测OD值，计算细胞生长抑制率。
1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡
取对数生长期的细胞以1×105个/mL密度接种于 6 孔培养板中，贴壁过夜，经药物孵育48 h后用0.25%无EDTA的胰酶消化收集所有细胞，每样本细胞数大于1×105个/mL，用预冷的PBS洗1次后，加 400 μL结合缓冲液，轻轻混匀细胞后加2.5 μL Annexin-FITC和2.5 μL PI，避光孵育20 min后立即进行流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。
1.3.5 線粒体膜电位检测
取对数生长期的细胞以1×105个/mL的密度接种于6 孔培养板中，贴壁过夜，经药物孵育48 h后用 0.25%无EDTA的胰酶消化收集所有细胞，每样本细胞数大于 1×105个/mL，用预冷的PBS洗1次：①将JC-1染料溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制备成浓度为1 μg/μL的JC-1工作液。②将100 μL细胞悬液（105个/mL）加入5 mL的流式测定管中，同时设阴性对照管。③在测定管中加入1 μL JC-1工作液，阴性对照管不加，轻轻混匀。④将测定管和阴性对照管置于培养箱中孵育15～20 min。⑤吸取500 μL PBS缓冲液分别加入测定管和对照管中，1000 rpm/mim，离心5 min，弃上清，重悬细胞。用流式细胞仪检测。流式细胞仪激发波为488 nm，红色荧光的最大发射波长为580/590 nm，绿色荧光的最大发射波长为510/527 nm，以红/绿荧光强度比值代表细胞线粒体膜电位的强度。
1.3.6 ELISA法检测Caspase-3、Caspase-9的活性
取对数生长期的细胞以1×105个/mL的密度接种于 6 孔培养板中，贴壁过夜，经药物孵育48 h后用 0.25%无EDTA的胰酶消化收集所有细胞，每样本细胞数大于1×105个/mL，用预冷的PBS洗1次，将细胞重悬于0.5 mL PBS中，-20℃冻存过夜，4℃解冻，反复三次。3000 rpm/min，10 min，离心，取上清，按ELISA试剂盒说明书要求检测。
1.4 统计学分析
细胞生长抑制实验每个浓度组设5个平行孔，其余实验设3个平行孔，使用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s） 表示，多组间比较使用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。
2 结果
2.1 细胞生长抑制率的测定
单因素方差分析显示，6组在24 h、48 h、72 h细胞生长抑制率的比较差异均有统计学意义（P<0.01），根据抑制的程度及作用时间，选择用药48 h作为后续实验用药时间。见表1。
2.2 PNS对BEL-7404细胞线粒体膜电位及细胞凋亡的影响
不同浓度的PNS均可降低BEL-7404细胞线粒体膜电位，100 μg/mL的PNS作用于肝癌细胞48 h后，细胞线粒体膜电位较对照组降低 （P<0.01），随着PNS浓度的增大，细胞凋亡率较对照组升高 （P<0.01）。见表2。
2.3 PNS 对BEL-7404细胞Caspase-3、Caspase-9的影响
与对照组比较，PNS 对BEL-7404细胞Caspase-3、Caspase-9的表达均有不同程度的增加。20 μg/mL的PNS作用于BEL-7404细胞48 h后，Caspase-9的表达量较对照组上升（P<0.05）;40 μg/mL的PNS作用于BEL-7404细胞48 h后Caspase-3的表达量较对照组上升（P<0.05）。见表3。
3 讨论
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）简称肝癌，是常见的恶性肿瘤之一，肝癌的迅速生长是癌细胞增殖旺盛与凋亡减少的结果，诱导癌细胞凋亡已成为筛选抗癌药物的新方向。近年的研究显示多种中药可诱导肝癌细胞的凋亡[2～5]，诱导肝癌细胞凋亡的机制，报道比较多的倾向于药物通过影响肝癌细胞增殖周期和抑制与癌发生相关基因的表达来达到防癌和抗癌的目的[6]。三七总皂苷的抗肿瘤作用研究也同样停留在抑制肿瘤细胞生长或转移等方面，对其诱导癌细胞凋亡的途径报道及信号传导甚少，由于其机制不明，未能在临床广泛应用。因此寻找三七总皂苷诱导肿瘤细胞凋亡的途径和靶点，不仅为肝癌的治疗提供了新的方法，同时也为中药的发展开辟了新的途径。
本研究将体外培养的BEL-7404 人肝癌细胞列为研究对象，用不同浓度的三七总皂苷作用于人肝癌细胞，应用流式细胞技术检测细胞线粒体膜电位的变化，探讨三七总皂苷对细胞线粒体膜电位的影响。实验结果显示，PNS 作用于BEL-7404细胞48 h后，与对照组比较，100 μg/mL组抑制率明显增大，线粒体膜电位降低，80 μg/mL、100 μg/mL组均可显著诱导BEL-7404细胞的凋亡。线粒体凋亡途径在细胞凋亡信号转导途径中是近年来研究的热门，是细胞凋亡途径的中心，线粒体膜电位凌乱是细胞凋亡时早期发生的细胞内事件之一，线粒体膜电位的丧失是细胞凋亡发生的必然途径[7～8]。随着研究的深入，最令人关注的是线粒体在细胞凋亡发生过程中的作用，以及各种线粒体蛋白在信号传导中的作用。其中Caspase相关蛋白在凋亡过程中起重要作用[9]。Caspase-9是凋亡的引发剂，Caspase-3 是细胞凋亡反应中的执行者和关键酶，直接参与介导细胞凋亡过程[10]。 通过活化脱氧核糖核酸酶，引起细胞染色体断裂，发生细胞凋亡。通过对Caspase-3、Caspase-9的结果分析显示，与对照组比较，PNS 作用于BEL-7404细胞48 h后，可以使BEL-7404细胞Caspase-9、Caspase-3表达增加，并且随浓度增加而增加。
总而言之，三七总皂苷可能通过降低细胞线粒体膜电位，造成线粒体涨大，释放细胞色素C到细胞液中，与凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）连接，并与procaspase-9聚集，导致Caspase-9的活化，活化的Caspase-9激活Cappase-3而导致细胞凋亡，产生抑制肿瘤细胞增殖的作用。本研究以线粒体膜电位作为新的切入点，通过与其相关的Caspase蛋白研究三七总皂苷的药理作用，将有助于发现三七总皂苷作用的新靶点和进一步阐明三七总皂苷防治肝癌的分子药理机制，为三七总皂苷对肿瘤细胞的作用靶点提供实验依据，有助于为三七应用于防治肝癌及预防提供理论依据，并在此基础上建立相关的中药药效筛选的细胞和分子模型。
参 考 文 献
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