SD大鼠急性脑梗死静脉溶栓后脑内VEGF的表达与出血性转化的关系
【摘要】 目的：研究大鼠急性脑梗死静脉溶栓后脑内VEGF的表达与出血性转化的关系。方法：建立大鼠自体血栓脑梗死模型，选择栓塞后不同时间点（6、9、12、24、30 h），采用Western Bloting方法测定缺血半暗带区VEGF 表达，比较溶栓组和对照组的差异，观察VEGF的表达与出血性转化的关系。结果：两组24 h VEGF的表达比较，差异有统计学意义（P=0.037，P<0.05）；出现出血的大鼠脑组织VEGF 半定量数值均明显高于该组均值。结论：大鼠自体血栓脑梗死后静脉溶栓治疗有促进缺血侧脑组织VEGF表达的趋势，VEGF可能与出血性转化形成有关。
【关键词】 急性脑梗死； 血管内皮细胞生长因子； 静脉溶栓； 出血性转化
中图分类号 R743.31 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）6-0152-02
在时间窗内通过静脉溶栓恢复血流是抢救急性脑梗死缺血半暗带区脑组织的有效手段[1]。继发性出血转化（HT）是急性脑梗死静脉溶栓后最严重的并发症。HT发生的相关机制涉及继发性纤溶亢进、血管壁坏死和血脑屏障通透性增加等[2]。其中，血脑屏障的通透性受多种因素调控，而血管内皮生长因子（VEGF）是目前已知作用最强的血管通透性因子，可以在数分钟内直接改变血脑屏障对一些大分子蛋白的通透性。动物实验证实，急性脑梗死后VEGF在缺血半暗带表达增加，因而有可能在静脉溶栓后促进HT的发生[3]。目前对于VEGF在急性脑梗死静脉溶栓后缺血半暗带的早期表达尚不清楚，本研究尝试对其进行探讨，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
Spraque Dawley大鼠80只，雌雄对半，体重300～350 g，按随机数字表法等分为脉溶栓组和对照组，根据栓塞后时间间隔（6，9，12，24，30人）再等分为5个亚组，每亚组8只。各个亚组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 大鼠自体血栓脑梗死模型
大鼠经3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉（每公斤体重10 ml），仰卧位固定，颈正中切口，分离、结扎右侧颈总、翼额、颈外动脉。在颈总动脉分叉处近端剪开一小口。用硬膜外留置导管插入颈内动脉至颅底遇阻力后停止，导流出动脉血，静置30 min后自凝形成约2.0 cm血栓，轻推移动血栓至遇轻微阻力后阻塞大脑中动脉起始处，夹闭总动脉后缝合。术中及麻醉期间小电热毯维持动物直肠温度36.5 ℃～37 ℃，注意观察呼吸及心率变化。建模成功表现为：左前肢持续屈曲，提尾实验阳性；侧推抵抗力减弱，转圈试验阳性。
1.3 静脉溶栓
溶栓组大鼠栓塞后2 h给予rtPA静脉溶栓治疗。根据鼠科动物对rtPA的耐受特点，给予总量10 mg/kg体重的rtPA，股静脉推注，持续40 min。对照组给予等量生理盐水。
1.4 组织取材
每个组动物均断头取脑。对于溶栓组大鼠，自嗅球尖端起，以3 mm间隔切片，观察是否存在出血於点与血肿，分别编号记录为：无出血（N）和存在激发出血（H），后者进一步分为出血於点（I，并记录数量），血肿（P）。文献[3]报道，采用组间等位定位法设定半暗带的等值区，所有动物均取剥取缺血侧大脑距离嗅球尖端7～11 mm、大脑矢状裂至外侧裂上1/3皮质组织，液氮保存。
1.5 VEGF 动态表达水平测定
分别取适量样品，将各样品稀释到相同的蛋白浓度，各取80 μl，各加入20 μl体积的5×上样buffer，95 ℃处理5 min。蛋白含量的测定采用Bradford比色法进行：用1 cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，并测量待测样品的A595，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。VEGF水平测定采用Western Bloting方法：SDS-PAGE电泳，转膜，Westernblot试剂盒检测，增强化学发光法（ECL）显影、定影，凝胶图象分析（Alpha Innotech）。
1.6 统计学处理
采用Excel 97软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行方差分析及t检验，计数资料采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组不同时间点VEGF 的表达
本组研究在栓塞后不同时间点，两组VEGF 的表达变化趋势基本一致，均在24 h达到高峰，之后下降。两组24 h VEGF的表达比较，差异有统计学意义（P=0.037，P<0.05），详见表1。
2.2 溶栓后出血及VEGF表达
溶栓后各亚组出现血肿（或出血点）的例数和VEGF 半定量数值分别为：6 h（0/8），9 h（1/8，601.77），12 h（1/8，813.44），24 h（2/8，1811.11、1697.96），30 h（1/8，1425.23）。未溶栓后各亚组出现血肿（或出血点）的例数和VEGF 半定量数值分别为：6 h（0/8），9 h（0/8），12 h（0/8），24 h（1/8，1326.12）， 30 h（1/8，987.56）。由于继发出血例数较少，无法进行相关统计学分析。但出现出血的大鼠脑组织VEGF半定量数值均明显高于该组均值，详见表1。
3 讨论
本研究结果提示，SD大鼠自体血栓脑梗死后rtPA静脉溶栓治疗有促进缺血侧脑组织VEGF表达的趋势，VEGF的表达可能与继发出血形成有关；在栓塞后24 h，溶栓组VEGF 的表达高于对照组（P<0.05）。
大鼠大脑中动脉栓塞后6 h，在缺血半暗带区就会出现VEGF蛋白的表达并逐渐增加，于24 h达到高峰，这与本研究中对照组VEGF mRNA的改变趋势一致。急性脑梗死后调节VEGF表达的机制并不十分清楚。目前已知低氧可以在转录与转录后水平上调VEGF的表达，低氧诱导因子（HIF-1）、NO等参与调节VEGF表达的一些环节。脑梗死后VEGF的生物学作用具有利弊兼有的双刃剑特点：一方面，促进血管形成和增强神经保护；另一方面，诱导脑屏障通透性增加和脑水肿形成，后者理论上利于脑梗死后的继发出血。
就溶栓治疗后HT而言，其确切机制尚不十分清楚。曾有作者设想可能与以下几点有关：（1）继发性纤溶亢进和凝血障碍；（2）缺血早期血管壁已经受损，恢复血供后，由于通透性增高而使血液渗出；（3）梗死后期血脑屏障的通透性增加而伴有再灌注出血。在本研究中，笔者发现静脉溶栓治疗有促进缺血侧脑组织VEGF表达的趋势，而VEGF的表达可能与继发血肿形成有关；在栓塞后24 h，溶栓组VEGF的表达达到最高峰，且明显高于对照组。从VEGF的生物学作用时间特点上看，VEGF的表达具有与促进HT发生的一致性。在发生梗死后出血的模型中，笔者的确发现VEGF的表达显著上升。上述结果提示，VEGF可能与HT形成有关。
对于静脉溶栓治疗促进缺血侧脑组织VEGF表达的机制，本实验不能解释。推测可能与溶栓治疗后保存了较多的具有生物学功能的脑组织，而后者提供了较多的VEGF生物学来源有关。由于本课题中实验动物数量较少，发生再出血的动物模型不足以进行统计学分析，因此相关结论只能从趋势上分析，需要更大样本的动物实验，但本课题的发现为笔者今后工作的研究方向建立了基础。
参考文献
[1]中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组. 中国急性缺血性卒中诊治指南2010[J].中华神经科杂志，2010，43（2）：146-153.
[2]Khatri R，McKinney A M，Swenson B，et al.Blood-brain barrier， reperfusion injury， and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke[J].Neurology，2012，79（13）：S52-57.
[3]徐晓云，李刚.糖尿病脑梗死大鼠血管内皮生长因子及其受体表达水平的变化[J].临床神经病学杂志，2008，21（2）：126-128.
（收稿日期：2013-10-18） （编辑：朱姣）