苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性测定

摘要：2007年8－10月从山东主要苹果产区轮纹病果上分离获得83个苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengriana f.sp.piricola)菌株，采用菌丝生长速率法分别测定了各菌株对多菌灵的敏感性。结果表明，多菌灵对83个菌株的EC₅₀值呈单峰频次分布，分布在0.019 6～0.486 7mg·L^-1，均值为0.108 0±0.015 2mg·L^-1；在83个菌株中选择对多菌灵最敏感的泰山海棠菌系进行重复测定，将其EC₅₀平均值0.042 8 mg,L^-1确定为苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感基线；通过Duncan氏新复极差法和系统聚类分析结果表明，不同地理来源的苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性都处在较高水平，总体上不存在明显差异，没有出现敏感性下降的抗药性亚群体。

关键词：苹果轮纹病菌：多菌灵：敏感性基线

中图分类号：S661.1　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2009)04-516－04

苹果轮纹病 (Botryosphaeria berengriana f.sp.piricola)是近年来苹果生产上危害最为严重的一种病害，不仅可以危害枝干，造成树势衰弱、枝干枯死，还能造成大量烂果，发病严重时田间病果率为70％～80％，且贮藏期可持续发病。给病发病率近年来呈上升趋势，给果农带来严重的经济损失。施用化学杀菌剂是目前防治苹果轮纹病的有效措施之一。其中以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂应用最为广泛。但由于该类药剂作用靶标单一，长期单一使用很容易使病原菌产生抗药性而导致药剂防效降低或丧失。马志强等监测了河北保定郊区苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性，发现所测定的菌株对多菌灵均已普遍产生不同程度的抗药性，但未发现高抗菌株。杨炜华等测定了部分县市区苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性，发现多菌灵在0.05 mg·L^-1质量浓度下即能明显抑制菌丝的生长，且测定的菌株均为低水平抗性菌株。山东省在防治苹果轮纹病上连续多年使用多菌灵，但至今仍缺乏对该病菌抗药性的研究报道。作者采用菌丝生长速率法，测定了多菌灵对山东不同地理来源的83个苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengriaria f.sp.piricola)菌株的毒力，建立了多菌灵对苹果轮纹病菌的敏感性基线，为开展其抗性检测与治理提供依据。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　供试菌株的采集和分离　2007年8－10月，分别在鲁东地区栖霞(Qx)、蓬莱(PL)、招远(ZY)、鲁中南地区沂源(YY)、蒙阴(MY)，鲁西地区肥城(FC)、泰山(Ts)、冠县(GX)、东阿(DE)，鲁北地区惠民(HM)、阳信(YX)的不同行政区域且相距一定距离的果园内，随机采集轮纹病果，装入干净的小塑料袋中(每个袋子只装一个标本)，带回实验室分离纯化后，共获得83苹果轮纹病菌株(Botryosphaeriaberengriana f.sp.piricola)。

1.1.2　供试药剂　97％多菌灵(carbendazim)原粉由山东华阳科技股份有限公司提供。

1.2　方法

1.2.1 含药培养基的配制 先将97％多菌灵原粉溶于0.1 mol·L^-1的盐酸溶液中，配成10 g·L^-1的母液，置4℃冰箱中备用，测定时，根据培养基的用量，用移液管吸取一定量的药剂母液加入溶化并冷却至50℃左右的培养基中，充分摇匀，配成含多菌灵系列浓度的含药培养基。每处理重复4次，以不加药剂为对照。

1.2.2　苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性测定　在PDA平板上培养(26℃，黑暗)4 d的参试菌株菌落边缘打出直径7 mm菌饼，分别移到含有多菌灵6个梯度浓度的PDA平板上，置26℃暗培养4 d，测定菌落径向线性生长量，确定药剂对菌落生长的抑制率。每处理(每菌株每浓度水平)重复4次。通过菌丝生长抑制概率值和药剂浓度对数值之间的线性回归分析，求出各药剂对各供试苹果轮纹病菌菌株的有效抑制中浓度(EC₅₀值)。

敏感性基线的确定方法，根据不同地区EC₅₀值测定结果，选择未曾施用多菌灵的采自泰山南天门的敏感菌株，进行方差分析，剔除EC₅₀值差异达显著水平的菌株，再重复测定差异未达显著水平的系列菌株的EC₅₀值，以重复测定敏感菌株的EC₅₀值的平均值为敏感性基线。

试验数据均由Microsoft Excel 2003、DPS数据处理工作平台进行统计分析。

抑制生长率(％)=[(对照菌落直径一处理菌落直径)／(对照菌落直径一菌饼直径)]x100

抗性指数=参试菌株EC₅₀值／本研究建立的敏感性基线EC₅₀值

2　结果与分析

2.1　苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性水平

2.1.1 苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性总体水平多菌灵对83个参试菌株的EC₅₀值均低于0.50 mg·L^-1，分布在0.019 6～0.486 7 mg·L^-1，均值为0.108 O±0.015 2 mg·L^-1，变异系数为0.652 7；其中，TS8为最敏感菌株(EC₅₀=0.019 6 mg·L^-1)，MY9最不敏感(EC₅₀=0.486 7 mg·L^-1)。从图1可以看出，除PL2(EC₅₀=0.328 50 mg·L^-1)、MY8(EC₅₀=0.322 O mg·L^-1)、MY9(EC₅₀=0.486 7 mg·L^-1)以外的80个菌株的EC₅₀值呈单峰曲线，接近正态分布(图1)。

2.1.2　苹果轮纹病菌对多茵灵的野生敏感基线　在83个菌株中选择对多菌灵比较敏感的泰山南天门苹果轮纹病菌进行重复测定，其EC₅₀值的测定结果见表1。7个菌株的ECho值为0.019 6～0.070 3mg·L^-1.平均EC₅₀值为0.042 8±0.008 0 mg·L^-1。由于泰山南天门菌系是对多菌灵最为敏感的菌系，因此可将这个菌系7次测定的平均EC₅₀值0.042 8±

0.008 0 mg·L^-1作为山东省苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性基线。

2.1.3　苹果轮纹病菌不同地理茵株对多茵灵敏感性的差异　采用Duncan氏新复极差法检验了多菌灵对8个地理菌株系列EC₅₀值的差异显著性。结果(表2)显示，8个菌株系列之间EC₅₀均值无极显著性差异，最高(PL，0.1607mg·L^-1)与最低(TS，0.042 8mg·L^-1)相差2.75倍；EC₅₀值的变异系数，最高(MY，0.949 0)与最低(QX，0.274 0)相差2.46倍。

2.1.4　不同地理来源菌株对多茵灵敏感性水平的系统聚类分析多菌灵对供试菌株EC₅₀值的离差平方和系统聚类分析结果(图2)表明，83个菌株EC₅₀值可分为由高到低的5个聚类组，第l组包括3个菌株(MY8、MY9、PL2)，第2组包括10个菌株(HM3、HM17、HM20、HM22、YY1、YY3、YY6、YY14、PL^-1、QX6)，第3组包括24个菌株(Qx1、Qx3、Qx15、YY2、YY4、YY8、YY9,YY10、YY13、YY15、HM2、HM4、HM11、HM12、HM24、MY1、MY6、YX1、YX7、GT2、PY7、PL3、ZY3、GX2)，第4组包括29个菌株(HM8、HM9、HM1O、HM13、HM18、HM19，HM21、QX4、QX5、QX7、QX8、QX10、QX12、QX13、YY18、MY3、MY4、MY10、MY11、P16、PL9、FC2、FC3、YX4、YX8、TS1、TS6、DE3、DE8)，第5组包括16个菌株(YX6、DE1、DE2、DE4、DE5、DE6、DE7、DE1O、TS2、TS3、TS7、TS8、TS9、MY5、HM26、YY17)。所有聚类组均包括不同的菌株系列，表明苹果轮纹病菌对多菌灵离体敏感性的地区性差异不明显。其中，HM、YY、MY系列菌株出现在4个聚类组中，QX、PL、YX系列菌株出现在3个聚类组中，TS、DE系列菌株出现在2个聚类组中。由此表明，各系列菌株对多菌灵敏感性的变化程度，HM、YY、MY最大，均大于QX、PL、YX，TS、DE的变化幅度最小，而这些均与Duncan新复极差法的分析结果相对应。

2.2　苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性现状

绝大多数参试菌株(96.39％)对多菌灵的EC₅₀值为0.019 6～0.208 5 mg·L^-1，相差9.64倍，均值为0.097 8±O.010 1 mg·L^-1，呈近正态的连续单峰频次分布，仅有3.61％参试菌株(PL2、MY8、MY9 EC₅₀值分别为0.328 5 mg·L^-1、0.322 O mg·L^-1、0.486 7 mg·L^-1)呈不连续分布。敏感性差异显著性检验结果及EC₅₀值离差平方和系统聚类分析结果均表明，不同地理来源的苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性总体上不存在明显差异。因此，目前苹果轮纹病菌对内吸性杀菌剂多菌灵的敏感性都处在较高水平，没有出现敏感性下降的抗药性亚群体。

3　讨　论

利用化学农药防治植物病害是植物病害综合防治措施之一，具有见效快，防病效果好等优点，但如果长期施用单一杀菌剂，特别是内吸性杀菌剂，易使病原菌产生抗药性。国外对苯并咪唑类杀菌剂引起植物病原菌产生抗药性的报道很多，在我国河北保定关于苹果轮纹病菌对多菌灵的抗药性也有相关报道。山东省在防治苹果轮纹病上也是连续多年使用多菌灵，但对是否已出现抗药性，迄今尚无研究报道，本文研究了多菌灵对山东省不同地理区域的苹果轮纹病菌离体抗菌活性。检测结果表明，不同地理来源苹果轮纹病菌对多菌灵离体敏感性存在着广泛的(不一定达到统计学意义上的显著性)差异。这与不同苹果产区的苹果种植年限、轮纹病的发生程度，当地农民的用药水平有关。对来自8个苹果产区77个菌株抗性的差异显著性检验结果以及对来自11个产区83个菌株抗性的系统聚类分析结果均表明，不同地理来源的苹果轮纹病菌对多菌灵离体敏感性总体上不存在显著差异。这可能因为多菌灵常与代森锰锌、福美双等保护剂交替使用而减少了使用量有关。马志强等测定了河北保定郊区，苹果轮纹病菌对多菌灵的抗药性水平，发现所测定的低抗、中抗菌株分别占63.6％、36.4％，未见高抗和特高抗菌株，而本实验室测定的菌株的EC₅₀值均小于O.400 0mg·L^-1，仅有1株MY9菌株EC₅₀值达到O.486 7 mg·L^-1(抗性指数=11.37)，可见尚未有抗药性亚群体出现。因此，山东省苹果轮纹病菌，已经对多菌灵产生了一定的抗药性，但抗药性水平不高，目前仍可将多菌灵作为防治苹果轮纹病菌的首选药剂。

但由于低抗性菌株的存在，抗药性群体在药剂选择压力下会不断发展，因此应结合本研究建立的敏感基线监测今后田间苹果轮纹病对多菌灵抗性的发展情况，以便尽早采取能应对措施，避免在田间出现严重抗药性问题。

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