山茱萸总苷干预急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡的研究
摘要：目的探讨山茱萸总苷对急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡的影响。方法原代培养乳鼠的心肌细胞，采用液状石蜡封闭法建立缺血缺氧模型，并将原代培养3d的心肌细胞分为对照组、缺氧组（1h、2h、3h、5h）及治疗组，药物浓度为生药10g/L，采用TUNEL法检测各组的凋亡率。结果与对照组相比，缺氧组各时间点凋亡率明显上升，差别有统计学意义（P<0.01）；与缺氧组比较，治疗组各个时间点的凋亡率都有所下降（P<0.01）。结论缺氧可以引起心肌细胞凋亡，并且随着缺氧时间的延长凋亡率上升，山茱萸总苷可以抑制心肌细胞的凋亡。
关键词：山茱萸总苷；急性缺氧；乳鼠；心肌细胞凋亡
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：16721349（2012）12148802
急性心肌梗死时心肌细胞死亡的方式不仅表现为细胞坏死，还表现为细胞凋亡。心肌细胞凋亡也是心肌梗死后心肌重构和心力衰竭的重要病理因素。因此，防治心肌细胞凋亡是现在一种重要的治疗目标。本研究观察了山茱萸总苷对急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡的防治作用。
1材料与方法
1.1动物出生1d～3d的SD大鼠，由中山大学实验动物中心提供。
1.2试剂DMEM/F12培养基，吉诺生物医药技术有限公司产品；DMEM无糖培养基，Gibco公司产品；胎牛血清，Gbico公司产品；0.25%胰蛋白酶，吉诺生物医药技术有限公司产品；青霉素链霉素溶液，Gibco公司产品；抗αSarcomericactin，武汉博士德生物有限公司产品；TUNELQIA39细胞凋亡试剂盒，购自Merck公司；SABC试剂盒及DAB显示试剂盒，购自武汉博士德生物有限公司。
1.3药物山茱萸，广东一方制药有限公司提供。
1.4主要仪器CO2细胞培养箱，Thermo公司；荧光显微镜，Nikon公司。
1.5方法
1.5.1山茱萸总苷提取物制备由广东省中医研究所按文献[1]方法提取，提取物浓缩干燥至粉末状。
1.5.2心肌细胞原代培养将出生1d～3d的SD大鼠，用75%酒精消毒后取出心脏，迅速放入4℃预冷DHank’s液的培养皿中，洗去心脏表面及血管中的血细胞，剪去心房和大血管。将心脏剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块，加入约10mL0.125%胰酶消化液，于37℃水浴箱中分次消化，每次约10min。收集除第1次以外的细胞悬液于50mL离心管中，加入含量为10%FBS的DMEM/F12培养液，终止消化。1000r/min离心5min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培养液，轻轻吹打使其形成单细胞悬液，将细胞悬液吸入培养皿中，按差速贴壁法于37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5h，去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。之后轻轻收集尚未贴壁的细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL～5×105/mL，接种于6孔培养板中。细胞于37℃、5%CO2环境中培养，每2天换一次液，培养3d～4d后使用[2]。
1.5.3实验分组缺氧模型组：正常培养3d的心肌细胞弃去培养液，换成无糖DMEM液，用无菌液状石蜡封住液体表面，使细胞缺氧[3]。对照组：心肌细胞不做任何处理，正常条件培养。山茱萸总苷干预组：细胞缺氧处理之前24h在培养液中加入0.49g/L的山茱萸总苷，缺氧培养的同时亦加入0.49g/L的山茱萸总苷进行干预。各组设1h、2h、3h、5h4个时间点进行指标观察。
1.5.4心肌细胞的鉴定按照SABC抗α横纹肌肌动蛋白试剂盒说明方法：将培养3d的细胞爬片，用4%多聚甲醛固定30min。然后用30%H2O21份+纯甲醇50份混合液室温浸泡30min后蒸馏水洗1次～2次，滴加5%BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体，滴加1∶100稀释的一抗（小鼠抗大鼠αSarcomericactin），对照组用蒸馏水代替一抗，37℃孵育1h，PBS洗2min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20min，PBS洗2min×3次。滴加试剂SABC，37℃20min，PBS洗5min×
1）为广东省中医药管理局课题基金资助项目（No.20111165）4次。二甲苯透明，中性树胶封片[4]。
1.5.5TUNEL检测心肌细胞的凋亡率将培养的细胞爬片，4%多聚甲醛固定，室温孵育10min后，将玻片浸没在1×TBS溶液中，室温孵育15min。每个样本玻片上滴加50μL～100μL浓度为20μg/mL的蛋白酶K溶液，室温孵育5min。用1×TBS溶清洗样本2次～3次。滴加100μL×TdT平衡缓冲液，室温孵育20min后，在每个样本上立即滴加60μLTdT标记反应混合物，置于湿盒中于37℃孵育90min。将样本玻片置于1×TBS溶液中室温孵育1min。去掉多余液体，换用新鲜1×TBS溶液室温孵育1min，重复1次。用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的TBS溶液，逐滴滴加MountingMedia封片剂并盖上盖玻片。使用荧光显微镜分别用330nm～380nm及465nm～495nm波长下激发荧光，计数所有细胞和凋亡细胞，计算出凋亡率[5]。
1.6统计学处理采用SPSS13.0进行数据分析，图片制作采用SPSS13.0及EXCEL进行，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，两组计量数据的比较采用t检验，多组数据之间的比较采用单因素方差分析（OnewayANOVA），检验水平取α=0.05。
2结果
2.1心肌细胞培养在倒置相差显微镜下观察，培养24h后，细胞已基本贴壁，并伸出伪足，形态呈梭形、菱形或不规则多边形。培养72h后，心肌细胞融合成片，形成单细胞层，细胞搏动呈现同步化，每分钟120次左右。
2.2心肌细胞鉴定心肌细胞中含有αSarcomericactin，本实验选用的一抗为小鼠抗大鼠α横纹肌肌动蛋白，因此染色后心肌细胞胞浆将被着深棕色，而非心肌细胞则呈阴性染色。心肌细胞的纯度鉴定采用每张玻片随机取10个视野，分别计算出心肌细胞阳性率，重复3次并取平均值为97.26%、96.875%、96.97%，三者取平均值为97.035%，因此本实验心肌细胞的纯度为97.035%。
2.3TUNEL检测心肌细胞的凋亡率（见表1）正常对照组心肌细胞凋亡率极低。而在心肌细胞缺氧2h后凋亡率明显增高，3h～5h后达到高峰，与对照组相比，差别有统计学意义（P<0.01）。用山茱萸总苷干预治疗后，治疗组与缺氧组相比凋亡率明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。
表1各组心肌细胞的凋亡率比较（x±s）%组别凋亡率对照组0.55±0.05缺氧组1h16.22±1.001）2h60.81±3.311）3h96.12±1.331）5h98.77±0.431）治疗组1h4.06±0.252）2h10.14±0.622）3h15.27±1.182）5h27.53±1.282）与对照组比较，1）P<0.01；与缺氧组相比，2）P<0.01
2.4山茱萸总苷干预急性缺血乳鼠心肌细胞TUNEL染色结果对照组正常心肌细胞阳性着色的细胞核很少；随着缺氧时间延长，阳性着色比例较对照组组明显增多；治疗组较缺氧组阳性着色比例明显减少。
3讨论
长期以来，细胞坏死一直被认为是缺血性心肌死亡的唯一方式[6]。但是最近研究结果显示，急性心肌梗死时早期心肌细胞死亡的主要方式为细胞凋亡，而不是心肌细胞的坏死，并且心肌梗死晚期也存在心肌细胞的凋亡[7，8]。心肌细胞凋亡与坏死是完全不同的，有研究[9]证实细胞凋亡于心肌缺血2h后发生，4h～5h时最明显，6h后开始减少，这点在本研究中也得到了验证。结果显示，原代培养的SD乳鼠心肌细胞在正常情况下几乎没有心肌细胞的凋亡，但在缺氧时可以引起心肌细胞的凋亡，并且随着缺氧时间的延长，凋亡细胞不断增加，缺氧5h时达到最高，凋亡率几乎达到98%。因此，防治心肌细胞凋亡是治疗急性心肌梗死新的治疗靶点。
现代药理研究表明，山茱萸总苷有抗炎和杀菌作用[10]，抗氧化损伤作用[11]，对急性缺血缺氧的心肌具有保护作用[12]。急性心肌缺血时线粒体的能量耗竭及活性氧的释放是导致心肌细胞凋亡和坏死的主要病理改变，已有研究证实，中药山茱萸对于实验性心肌梗死大鼠模型的心肌细胞具有保护作用。本实验研究发现，给予山茱萸总苷干预后，缺氧乳鼠心肌细胞凋亡率明显下降，而且各个时间点的凋亡率均降低。可见山茱萸总苷可以抑制心肌细胞的凋亡，保护缺氧心肌细胞。但山茱萸总苷通过什么作用途径抑制心肌细胞凋亡，尚需深入研究。
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