C—型钠尿肽对大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响
摘要：目的 观察C 型钠尿肽（CNP）对大鼠心肌成纤维细胞（CFs）增殖及胶原合成的影响，探讨其抑制心肌细胞外基质（ECM）重构的作用机制。 方法 原代培养新生大鼠CFs，应用MTS法分析细胞增殖，以Western blot法检测CFs中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的蛋白表达。 结果 10-9 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L CNP能显著 抑制CFs的增殖（ P <0.05），同时抑制CFs中Ⅰ型胶原（ P <0.05）、 Ⅲ型胶原（ P <0.05）的蛋白表达，并具有浓度依赖性。 结论 CNP能有效抑制CFs的增殖及胶原合成，这可能是其抑制心肌ECM重构的重要机制。
关键词： C 型钠尿肽；心肌成纤维细胞；胶原合成
中图分类号 ：R329.2 文献标识码：A
doi： 10.3969/j.issn.1672 1349.2014.10.040
文章编号：1672 1349（2014）10 1246 02
多种心脏病均导致心肌纤维化的发生，在心肌组织中，心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）是数量最多的一类细胞，心肌纤维化中的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重构过程中，CFs居于核心地位，发挥着最重要的作用[1，2]。钠尿肽家族（natriuretic peptides）对心血管功能具有多方面的影响[3，4]。以往研究多集中在心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、脑钠尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）上，而对于C 型钠尿肽（C type natriuretic peptide，CNP）的研究还很不充分，有研究表明CNP对于心肌重构中常伴随发生的纤维化过程具有抑制作用[5，6]，而其具体机制目前尚不清楚。本研究采用体外培养的大鼠CFs，观察CNP对其增殖、细胞外基质成分如Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响，从而在细胞水平方面探讨CNP抑制心肌ECM重构的作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 MTS细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司；Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原小鼠单克隆一抗抗体购自美国Abcam公司；CNP购自美国Bachem公司，GAPDH小鼠单克隆一抗抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 细胞培养和分组 选用1 d～3 d新生Sprague Dawley大鼠（SPF级），于无菌条件下开胸取心室肌，用眼科剪碎块后，置于0.08%胰蛋白酶中，于37 ℃消化并收集消化液，反复数次至消化完全后，将全部消化液离心，弃去上清，细胞沉淀加入含10%血清的DMEM培养液中，充分混悬后，接种于培养瓶中，差速贴壁法分离获得CFs，分离得到的CFs进行传代，第2代～第3代细胞用于实验。达到70%～80%融合后 的CFs，血清饥饿24 h，使细胞同步化后进行后续实 验。 细胞随机分为对照组和给予不同浓度（10-9 mol/L、 10-8 mol/L、10-7 mol/L）的 CNP处理组，继续培养 24 h。
1.3 MTS法检测 CFs达到70%～80%融合后，胰酶消化混悬细胞，以5×103个/孔的密度均匀接种于96孔培养板中，培养过夜后，无血清DMEM饥饿24 h，使其同步化。分为空白对照组，余下各组加入不同浓度CNP，使其终浓度分别为10-9 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L，同时设立调零组，其各孔内无细胞，只加培养液。继续培养24 h后，将每孔中的培养液吸弃，加入100 μL新鲜DMEM培养液，然后再加入20 μL MTS显色试剂，震荡使其充分混匀，37 ℃培养箱中继续孵育1.5 h后，于酶标仪570 nm处测定各孔吸光光度值，细胞增殖活力以调零后的测定组与对照组的吸光光度值之比来表示。
1.4 Western blot检测 胰酶消化法收集各组细胞，弃上清，PBS洗3遍，加入细胞裂解液，于4 ℃裂解30 min后， 4 ℃，12 000 r/min离心，收集上清， BCA法测定蛋白提取液的总蛋白浓度。含等量蛋白（60 μg）的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜，加Ⅰ型胶原一抗（1∶2 000）或Ⅲ型胶原一抗（1∶1 000），或GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，洗膜，加HRP标记山羊抗小鼠二抗（1∶10 000），室温孵育1.5 h，洗膜，ECL法显色并扫描记录条带，用Quantity One软件测定分析各条带的灰度值。
1.5 统计学处理
3 讨 论
CFs是心肌组织中数量最多的细胞类型，约占70%，多种心脏疾病，如高血压、心肌梗死、风湿性心脏病等情况下，往往导致包括心肌纤维化在内的心肌重构的发生，心肌纤维化包括CFs数量上的异常增多及心肌ECM成分代谢的失衡。CFs自身的增殖和对ECM成分如Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达的调控，对于心肌纤维化有着极为重要的意义，也是ECM重构的主要方面。尽管在初期，CFs生物学功能的改变有益于心肌组织的修复并利于心功能的维持，但在病理因素的持续刺激下，随着纤维化程度的不断加重，其长期效应则导致心肌僵硬度的持续增高，并最终导致心力衰竭的发生[1，2]。
钠尿肽家族主要包括ANP、BNP、CNP等，已有研究表明这些多肽能调节心血管系统多方面的功能。以往较多的关注均集中于ANP和BNP，研究发现其主要由心肌细胞分泌，在多种心脏病心肌组织中表达升高，并对CFs及心肌细胞的增殖、肥大等生物学功能具有抑制作用[3，4]。CNP是由22个氨基酸组成的多肽，最初是在猪脑提取物中分离发现的，以往研究表明其对于血管损伤后内膜的形成具有抑制作用[7]。在心血管疾病领域，有研究报道CNP表达上调与动脉粥样硬化及再狭窄病变的发生有关[8，9]。最近研究发现，心肌组织也是CNP的重要合成部位，其表达在慢性心力衰竭病人心肌组织中升高[10]。CNP主要通过旁分泌和自分泌作用影响心血管系统功能，在心肌组织中，CFs是CNP的重要来源细胞[5]。动物实验表明，CNP对心肌纤维化具有抑制作用，这可能是由其对细胞内 cGMP/PKG 信号转导通路的激活作用所致[6]。而CNP对CFs生物学功能及ECM蛋白表达的影响如何，目前尚不完全清楚。本研究结果表明，CNP能显著抑制大鼠CFs的增殖，并能下调Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白在CFs中的表达，这可能是其抑制心肌ECM重构的重要机制。在心血管病治疗领域，CNP因其显著的抗心肌纤维化作用，有望在将来用于抑制心肌重构的临床治疗之中。
参考文献：
[1] Porter KE，Turner NA.Cardiac fibroblasts：At the heart of myocardial remodeling[J].Pharmacology & Therapeutics，2009，123：255 278.
[2] Souders CA，Bowers SL，Baudino TA.Cardiac fibroblast：The renaissance cell[J].Cir Res，2009，105：1164 1176.
[3] Potter LR，Abbey Hoesch S，Dickey DM.Natriuretic peptides，their receptors，and cyclic guanosine monophosphate depe ndent signaling functions[J].Endocr Rev，2006，27：47 72.
[4] Gardner DG，Chen S，Glenn DJ， et al .Molecular biology of the natriuretic peptide system：Implications for physiology and hypertension[J].Hypertension，2007，49：419 426.
[5] Horio T，Tokudome T，Maki T， et al .Gene expression，secretion，and autocrine action of C type natriuretic peptide in cultured adult rat cardiac fibroblasts[J].Endocrinology，2003，144：2279 2284.
[6] Soeki T，Kishimoto I，Okumura H， et al .C type natriuretic peptide，a novel antifibrotic and antihypertrophic agent，prevents cardiac remodeling after myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol，2005，45：608 616.
[7] Furuya M，Miyazaki T，Honbou N， et al .C type natriuretic peptide inhibits intimal thickening after vascular injury[J].Ann NY Acad Sci，1995，748：517 523.
[8] Naruko T，Ueda M，van der Wal AC， et al .C type natriuretic peptide in human atherosclerotic lesions[J].Circulation，1996，94：3103 3108.
[9] Naruko T，Itoh A，Haze K， et al .C type natriuretic peptid e and natriuretic peptide receptors are expressed by smooth muscle cells in the neointima after percutaneous coronary intervention[J].Atherosclerosis，2005，181：241 250.
[10] Kalra PR，Clague JR，Bolger AP， et al .Myocardial production of C type natriuretic peptide in chronic heart failure[J].Circulation，2003，107：571 573.
（收稿日期：2014 06 01）
（本文编辑 郭怀印）
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