流式细胞术在兽医临床上的应用研究
摘要 本文介绍了流式细胞术的工作原理，阐述了流式细胞术近年来在兽医病毒感染诊断、寄生虫诊断、微量元素检测3个方面的临床应用研究，并展望了流式细胞术在畜禽疾病诊断和预防方面的应用前景，以期为流式细胞术在兽医临床上的应用提供参考。
关键词 流式细胞术；病毒感染；寄生虫诊断；微量元素
中图分类号 R446 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）21-0239-02
Application Research of Flow Cytometry in Veterinary Clinic
YU Juan 1 XU Yan-zhao 1 LIU Xing-you 2 *
（1 Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang Henan 453003； 2 Xinxiang University）
Abstract This paper introduced the working principle of flow cytometry，expounded the application research of flow cytometry in veterinary virus infection，parasites diagnosis，trace element detection，and its application prospect in livestock and poultry disease diagnosis and prevention were prospected，in order to provide references for the application of flow cytometry in veterinary clinic.
Key words flow cytometry；virus infection；parasites diagnosis；trace element detection
流式细胞术是一种现代细胞检测技术，即利用流式细胞仪对悬浮于流体中的细胞或其他生物微粒进行理化特征分析、计数和分选[1]。早期主要应用于医学领域中的肿瘤学和血液学研究，近年來，随着免疫学、生物化学、微生物学、分子生物学等学科的迅猛发展、相互渗透和交叉，已应用到细菌、真菌和病毒的快速检测及微生物群落结构领域。此外，这一技术不仅应用于科研、教学等不同领域的研究，而且为畜牧生产等领域提供了强有力的工具。
1 工作原理
流式细胞术检测的对象是细胞，并且是悬浮于液体中、呈独立状态的细胞。在一定压力下，鞘液带着悬浮的细胞进入流式照射室，特定波长的激光束直接照射到细胞后发生散射和折射，发射出散射光，细胞上结合的荧光素被激光激发后产生荧光，不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增管检测器，转换成电信号，被相应的接收器接收后放大，再经过数据化处理输入电脑并储存，从而分析出每个细胞的物理化学特征。
2 在兽医临床上的应用研究
2.1 病毒感染诊断方面
流式细胞术是一种简便、快速分析待测细胞的种类、亚类及其功能等特性的技术，最早应用于人医免疫检测，近年来已广泛应用于免疫细胞表面标志及细胞内细胞因子检测等方面[2]。淋巴细胞亚群（如CD3、CD4和CD8）和表型分析在免疫功能检测中具有重要的意义，特别是随着近年来免疫学研究的快速发展，淋巴细胞亚群和表型分析也广泛应用于兽医临床研究。CD3分子与T细胞抗原受体（TCR）通过非共价键连接，形成TCR_CD3复合物，TCR识别抗原后，通过CD3传导刺激信号，在体外可产生多种细胞因子，从而诱导细胞毒作用，增强T细胞、LAK细胞和NK细胞的杀伤力。CD4分子主要分布在淋巴细胞和胸腺细胞表面，有黏附、细胞间信号传导和HIV受体等功能[3]。CD8分子是细胞间黏附分子，也分布于淋巴细胞和胸腺细胞的表面，具有信号传导作用。
在兽医临床上，检测淋巴细胞亚群的表达数量及比值的变化对疾病预防及治疗进程的监测具有重要意义[4]。李 华等[5]利用流式细胞术通过检测SPF仔猪感染PRRS病毒后BJ-4外周血淋巴细胞亚群的动态，得出淋巴细胞各亚群的比例下降，抑制了机体对病原体的免疫反应，这些比值变化也揭示了其他病原体的混合感染或继发感染。司兴奎等[6]利用流式细胞术对猪前腔静脉血中的CD4/CD8进行检测，研究了猪圆环病毒2型感染对伪狂犬疫苗免疫应答的影响，结果表明，PCV2感染在一定程度上影响了机体T细胞和B细胞对抗原的识别功能，抑制了机体特异性细胞免疫，这一研究对临床PR疫苗免疫具有重要意义。齐 伟[7]以流式细胞术为基础，对REV感染的SPF雏鸡免疫器官中淋巴细胞周期分布及CD4+、CD8+T淋巴细胞数量及比值变化进行检测，研究了REV感染对SPF雏鸡免疫器官的免疫功能的影响，为RE的防治提供了理论基础。邹 璐等[8]对不同日龄仔猪外周血T淋巴细胞进行检测与分析，建立了健康仔猪外周血淋巴细胞亚群的临床参考范围，为不同生长阶段仔猪的免疫系统功能水平监测奠定了基础。通过对畜禽淋巴细胞各亚群的数量和比值变化测定来监控畜禽的免疫状态，监控畜禽病毒传染性疾病，能制定更有效的预防治疗措施。
2.2 寄生虫诊断方面
畜禽寄生虫病感染宿主在临床上多处于非清除性免疫状态，寄生虫种类多，分布广泛，重复感染机会很多，严重影响动物的身体健康，损害其繁殖性能，抑制幼年动物的生长发育，极大地削弱了其生产性能，导致畜产品的数量和质量降低。
近年来，随着流式细胞仪的推广应用，利用流式细胞术在寄生虫感染诊断方面的研究应用也较广。崔 洋等[9]利用流式细胞术检测了约氏疟原虫感染小鼠脾脏巨噬细胞后膜分子CD36和CD64的变化动态，结果表明，随着感染时间的延长，CD36和CD64表达水平逐渐升高至峰值，并通过吞噬方式杀伤疟原虫，此研究证明巨噬细胞是小鼠发挥抗疟原虫感染的保护性效应细胞。周永华等[10]应用流式细胞术对弓形虫感染后大鼠外周血T细胞亚群的变化进行检测，结果表明，机体在抗弓形虫感染免疫中，T细胞亚群产生了大量的细胞因子，在抗弓形虫感染中起着重要的作用。徐 鹏等[11]运用流式细胞术对仔猪人工感染猪囊尾蚴虫后外周血中淋巴细胞亚群的动态变化进行了研究，通过对CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞数量的检测，客观地反映了机体细胞免疫状况。利用流式细胞术从细胞水平上检测寄生虫感染后淋巴细胞亚群及相关细胞因子的变化，对寄生虫病的预防控制与早期治疗具有重要意义，已应用于多种寄生虫感染的辅助检查，可以较快获知感染时期、感染程度等。
2.3 微量元素检测方面
微量元素是动物体必需的营养元素，直接参与机体几乎所有的生理、生化活动，对动物的新陈代谢、生长发育及生产性能影响较大。因此，在畜禽日粮中微量元素的添加日益受到关注。由于对饲料中微量元素含量及其利用率缺乏系统准确的分析，生产中微量元素添加存在盲目性，且添加量普遍过高[12]。过量的微量元素大部分随排泄物进入环境，造成环境污染。
研究微量元素日粮对畜禽生产性能的影响，对提高微量元素的利用率、减少排放和控制环境污染具有重要意义。崔恒敏等[13]利用流式细胞术研究了铜添加量对雏鸡淋巴细胞凋亡的影响，结果表明，日粮铜含量超过400 mg/kg，活性淋巴细胞数量减少，导致机体免疫功能受损。龚 涛等[14]研究了高氟日粮对雏鸡肝细胞周期和凋亡的影响，流式细胞术试验结果显示，日粮含氟400 mg/kg时，对雏鸡肝脏生长发育无显著影响；但是日粮含氟800、1 200 mg/kg时，能增强肝细胞增殖能力，使凋亡细胞显著增多。陈 涛等[15]用流式细胞术研究了高氟日粮对雏鸡法氏囊淋巴细胞增殖分化的影响发现，日粮含氟400 mg/kg时，对雏鸡法氏囊生长发育无显著影响；而日粮含氟800、1200 mg/kg时，会引起法氏囊淋巴细胞增殖分化受阻，法氏囊生长发育受抑，凋亡细胞显著增多，机体体液免疫功能受损。崔 伟等[16]用流式细胞术研究了高铜对雏鸭肾脏细胞周期和凋亡的影响，结果表明，日粮添加铜达到400 mg/kg以上时，肾脏细胞增殖分化严重受阻，肾脏细胞凋亡大量增加，导致肾脏功能严重受损。彭西[17]利用流式细胞术研究日粮硒对雏鸡免疫功能影响的机理发现，日粮硒水平达到5 mg/kg以上会导致免疫器官细胞分裂增殖能力下降、凋亡细胞增多；外周血T淋巴细胞增殖能力降低，CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞数量下降，进而导致免疫器官生长发育受阻，出现病理损伤，严重影响其生长发育。
微量元素作为多种酶的构成成分和活性成分，同时也是动物体内免疫因子之一，从消化、吸收、利用各个层次调控动物体内能量、蛋白质等的代谢过程，并调控机体内分泌、调节体内离子平衡和渗透压，调节机体神经体液机制和免疫反应等，对动物健康至关重要[18-19]。科学合理添加日粮中微量元素的含量不仅能提高畜禽的生产性能，而且可以减少微量元素的滥用排放，降低养殖业对环境的污染。
3 展望
流式细胞术是对单细胞进行定量分析和分选的一门检测技术，具有分析快速[20-21]、檢测指标多、数据量大、应用范围广等优点。流式细胞术在细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学等领域的研究中已得到广泛应用。近年来，随着各新型流式细胞仪的开发，各荧光染料的充分发展，流式细胞术在畜禽疾病诊断方面的研究也较为普遍，为畜牧养殖业提供了重要的诊断依据[22-25]。随着流式细胞仪小型化、操作简单化的发展，流式细胞术在畜禽疾病诊断和预防方面将有更广阔的应用前景。
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