片仔癀对裸鼠人骨肉瘤肿瘤干细胞移植瘤生长的影响
[摘要] 目的 探讨片仔癀对裸鼠人骨肉瘤肿瘤干细胞移植瘤的抑制作用及其对ABCB1、ABCG2蛋白表达的影响。 方法 48只裸鼠皮下接种肿瘤干细胞建立人骨肉瘤肿瘤干细胞移植瘤模型。依照随机数字表法将其分为对照组、阿霉素组、片仔癀组、片仔癀与阿霉素联合组，每组各12只，分别予以相应的干预，4周后处死裸鼠，测量瘤体体积及称取其重量，计算肿瘤体积及重量抑制率；免疫组织组化学（SP法）及Western blot检测瘤体内ABCB1、ABCG2的表达。 结果 与对照组比较，阿霉素组、片仔癀组、联合组瘤体体积及重量明显降低（P < 0.05），与片仔癀组比较，联合组生长受到明显抑制（P < 0.01）；与对照组比较，片仔癀组、联合组可明显降低ABCB1、ABCG2的表达（P < 0.05），且联合组较片仔癀组明显下调（P < 0.05）。 结论 片仔癀可明显抑制人骨肉瘤肿瘤干细胞裸鼠移植瘤的生长，且能够增强阿霉素的作用，其作用机制与抑制膜转运蛋白ABCB1、ABCG2的表达相关。
[关键词] 片仔癀；骨肉瘤；干细胞移植瘤；影响
[中图分类号] R738.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（a）-0004-05
[Abstract] Objective To explore the inhibitory effect of Pien Tze Huang on the growth of human osteosarcoma stem cells transplantation tumor of nude mice and its effect on ABCB1 and ABCG2 protein expression. Methods The model of human osteosarcoma tumor stem cell transplantation tumor was established by subcutaneous tumor stem cells in nude mice. According to the random number table method ， 48 nude mice were divided into control group， adriamycin group， Pien Tze Huang group， Pien Tze Huang and adriamycin combined group， with 12 mice in each group， The nude mice were executed after four weeks of intervention. The volume and weight of the tumor were measured and the tumor volume and weight inhibition rate were calculated. The expression of ABCB1 and ABCG2 in the tumor was detected by immunohistochemistry （SP） and Western blot. Results Compared with the control group， the volume and weight of tumor were significantly reduced in theadriamycin group， Pien Tze Huang group and combined group （P < 0.05）. Compared with Pien Tze Huang group， the combined group growth was significantly inhibited. （P < 0.01）. SP and Western blot results showed that the expressions of ABCB1 and ABCG2 in the Pien Tze Huang group and combined group were significantly down-regulated than that in the control group （P < 0.05）， and combined group was significantly lower than that in the Pien Tze Huang group （P < 0.05）. Conclusion Pien Tze Huang can significantly inhibit the growth of tumor stem cells in human osteosarcoma tumor stem cells， and it can enhance the effect of adriamycin. Which may be related to inhibit the expression of membrane transporter ABCB1 and ABCG2.
[Key words] Pien Tze Huang； Osteosarcoma； Stem cell transplantation tumor； Effect
骨肉瘤好發于青少年，恶性程度高，早期即可发生转移，尽管随着医疗技术的提高，目前患者5年生存率可达到70%，但仍有30%患者因对化疗药物的耐药而导致治疗失败[1]。前期大量的研究表明多种机制与骨肉瘤化疗耐药的产生有关[2-3]，包括ABC转运蛋白的过表达，细胞凋亡调控异常，细胞内解毒系统紊乱及肿瘤干细胞的存在等[4-5]。研究发现肿瘤干细胞能通过上调ABC转运蛋白的表达等作用，使其对化疗药物具有耐药性，成为肿瘤耐药的重要原因[6]。我们前期实验发现骨肉瘤干细胞中高表达ABCB1、ABCG2蛋白，片仔癀可明显抑制耐药骨肉瘤干细胞的增殖，抑制ABCB1、ABCG2蛋白表达，逆转其耐药[7]。本实验通过观察片仔癀对裸鼠人骨肉瘤肿瘤干细胞移植瘤及其ABCB1、ABCG2的表达影响，进一步探讨片仔癀对骨肉瘤耐药性的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞系及裸鼠
人骨肉瘤MG63细胞由中国科学院上海生命科学研究院提供，MG63/ADM细胞株通过ADM大剂量间隙作用诱导而成[8]。BABL/C裸鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，4～6周龄，体重（14±2）g，雌雄各半。饲养于福建中医药大学实验动物中心[许可证号SYXK（闽）2009-0001]，室温控制在（25±1）℃，相对湿度为40%～60%的SPF层流柜中。
1.2 主要试剂
DMEM/F12（美国Gibco公司，批号：NZE1197）；Accutase酶（美国invitrogen公司，批号：A1110507）；B-27（美国Hyclone公司，批号：1626662）；内皮生长因子（EGF）（美國PeproTech公司，批号：0216AFC05）；碱性成纤维生长因子（bFGF）（美国PeproTech公司，批号：0413AFC08）；ABCB1单克隆抗体、ABCG2单克隆抗体、HRP标记羊抗兔IgG二抗、HRP标记羊抗鼠IgG二抗（美国CST公司，批号：0003、0006、25、29）；片仔癀胶囊（漳州片仔癀药业有限公司，规格：300 mg/粒，批号：1101007）；阿霉素（深圳万乐药业有限公司，批号：1103E3）。
1.3骨肉瘤干细胞的培养
将对数期MG63/ADM细胞胰酶消化制成单细胞悬液，PBS洗涤离心去除残留血清，以5×103个细胞每孔的密度传到低黏附6孔板，无血清培养基（终浓度为EGF20 ng/mL、bFGF20 ng/mL、B-27 2%的DMEM/F12培养基）培养，待细胞球长至70 μm大小，为第1代细胞球，收集细胞悬液，800 r/min离心去除上清后加入accutase酶吹打成单细胞悬液，细胞计数后，以5×103个细胞密度接种到低黏附6孔板中继续培养，连续培养至3代。以获得的第3代悬浮细胞球为实验对象。
1.4 骨肉瘤肿瘤干细胞裸鼠移植瘤模型建立及分组
取第3代悬浮细胞球，accutase酶消化，不含血清的DMEM高糖培养基洗涤2次，调整细胞浓度为2×106个/mL细胞悬液，按200 μL/只接种于裸鼠右腋前皮下。接种1周后，48只裸鼠依照随机数字表分成4组，分别干预4周。对照组每日予0.2 mL生理盐水灌胃，同时每隔2 d予以0.2 mL生理盐水腹腔注射；片仔癀组每日予片仔癀溶液（浓度30 mg/mL）灌胃，给药剂量按照小鼠给药剂量与人的体表面积关系计算；阿霉素组予以阿霉素1 mg/kg腹腔注射2 d/次；联合组中片仔癀给药同片仔癀组，阿霉素给药同阿霉素组。
1.5 标本采集及计算肿瘤抑制率
末次给药24 h后颈椎脱臼处死裸鼠，剥离裸鼠皮下瘤体，测量瘤体体积及称重，计算肿瘤体积、重量抑制率。肿瘤体积抑制率（V）=（V对照组-V实验组）/V对照组×100%，肿瘤重量抑制率[肿瘤重量抑制率（W）=（W对照组-W实验组）/W对照组×100%]。
将瘤体分为两部分：一部份瘤体4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，用于免疫组化检测。另一部份-80℃保存，用于Western blot检测。
1.6 免疫组化检测移植瘤内ABCB1、ABCG2的表达情况
瘤体置于4%多聚甲醛固定24 h后，经逐级脱水石蜡包埋，切片脱腊水化后抗原修复，封闭，滴加一抗ABCB1（1∶800）、ABCG2（1∶1000）4℃过夜后滴加二抗室温孵育2 h，DAB染色后观察比较阳性目标积分光密度。
1.7 Westen blot检测瘤体内ABCB1、ABCG2的表达
将各组瘤体RIPA裂解液充分研磨，置于冰上裂解15 min，提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度。加入5×上样缓冲液，混匀、变性后置于-20℃保存。每孔30 μg总蛋白上样，进行聚丙烯酰胺凝胶（分离胶浓度10%、浓缩胶浓度5%）电泳，将蛋白转至PVDF上，室温封闭2 h，置于稀释的一抗ABCB1（1∶1000）、ABCG2（1∶1000），4℃冰箱摇床上孵育过夜，HRP标记的二抗（1∶5000）室温孵育1 h，TBST洗涤3次，加入适量的ECL显影剂，以β-actin为内参，凝胶成像系统扫描并进行数据分析。
1.8 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用One-Way ANOVA 方差分析，两组间比较采用LSD检验，方差不齐采用Duunett′s T3法，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 片仔癀对骨肉瘤肿瘤干细胞裸鼠移植瘤体积及重量的影响
与对照组比较，各用药组瘤体体积及重量均有减少（P < 0.05）；与阿霉素组比较，片仔癀组肿瘤体积抑制率及重量抑制率高（P < 0.01）；与片仔癀组比较，联合组瘤体体积抑制率及重量抑制率明显增高（P < 0.01），提示裸鼠移植瘤生长受到了明显抑制。见表1、2。
2.2 免疫组化检测片仔癀对骨肉瘤肿瘤干细胞裸鼠移植瘤ABCB1、ABCG2表达的影响
免疫组化中ABCB1、ABCG2在细胞膜上成棕黄色阳性表达，检测如图1、2所示，对照组、阿霉素组、片仔癀组、联合组中阳性目标积分光密度表达呈逐渐降低趋势。阳性目标积分光密度阿霉素组与对照组比较未见明显差异；片仔癀组、联合组与对照组比较，阳性目标积分光密度明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），联合组阳性目标积分光密度最低，与片仔癀组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。
2.3 Western blot检测片仔癀对裸鼠移植瘤ABCB1、ABCG2表达的影响
各组内参蛋白β-actin的表达经统计学分析差异无统计学意义（P > 0.05）。与对照组比较，阿霉素组ABCB1、ABCG2蛋白表达差异无统计学意义（P > 0.05）；片仔癀组和联合组的ABCB1、ABCG2蛋白表达降低，与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.01）。见图3。
3 讨论
骨肉瘤对化疗药物的耐药是目前临床治疗的一个瓶颈问题，其产生机制与多种因素有关，近期发现肿瘤干细胞与骨肉瘤耐药的发生有重要关系[9]。骨肉瘤干细胞拥有强大的自我更新能力和多向分化能力，2005年Gibbs等[10]首先在采用无血清条件下从骨肉瘤细胞中分离出表达多功能胚胎干细胞标志物的骨肉瘤干细胞，发现这些多处于静止期或休眠期，使得其对作用于细胞周期的化疗药物不敏感。骨肉瘤干细胞具有增强DNA修复能力，上调ABC 转运蛋白的表达等作用，在化疗过程中能逃避化疗药物的毒性作用，一旦化疗药物作用消失，该类细胞可以通过自我更新、无限增殖使肿瘤出现复发转移[11]。有学者认为肿瘤是一种干细胞疾病，肿瘤的耐药性产生于肿瘤干细胞的生物学特性密切相关，只有消除肿瘤干细胞才有可能解决肿瘤治疗的耐药问题，提高疗效[12]。
在中医学中骨肉瘤属“石痈”“石疽”“石岩”等范畴。《医宗金鉴·外科心法》：“膝痛，欣肿色红痛，疵疽如痛而不红，红软为顺，坚硬为逆”和“下石疽在膝上生”描述了骨肉瘤的症状及发生部位。根据其病因病机，历代医家从不同的侧面对本病的认识和治法作了探索和补充，多认为与“毒邪”关系密切，常予化瘀散结清热解毒之法[13]。片仔癀是传统名贵中成药由三七、麝香、牛黄、蛇胆等天然药材组成。具有清热解毒、消肿散结、活血化瘀的显著功效。片仔癀可通过抑制PI3K/Akt信号途径的激活，诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡；通过抑制P-gp蛋白的表达增加骨肉瘤阿霉素耐药细胞对化疗药物的敏感性，逆转骨肉瘤耐药的作用[14-15]。
我们前期通过体外实验发现，通过无血清培养的骨肉瘤干细胞高表达ABCB1、ABCG2，使用片仔癀可抑制骨肉瘤干细胞的生长，下调ABCB1、ABCG2蛋白表达[7]。本研究在此基础上，建立骨肉瘤干细胞裸鼠移植瘤模型，观察片仔癀对骨肉瘤干细胞移植瘤的影响。研究结果表明，片仔癀、片仔癀与阿霉素联用可明显抑制裸鼠移植瘤的生长，表现为瘤体体积及重量抑制率较对照组明显增高，并且片仔癀与阿霉素联合应用对肿瘤生长抑制最为明显，说明片仔癀对骨肉瘤干细胞裸鼠移植瘤具有抑制作用，同时在体内对阿霉素具有化疗增敏作用。
ABCB1、ABCG2属于ABC转运蛋白的超家族成员，其可依赖 “药泵”作用，一边结合ATP，一边结合药物，通过ATP供能，将药物从细胞内泵出细胞外，使细胞内化疗药物的浓度降低，减少化疗药物对肿瘤细胞的毒性，表现为肿瘤细胞对不同化疗药物的耐药[16]。Gomes等[17]发现骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性与ABCBl、ABCG2表达水平密切相关，ABCBl、ABCG2水平越高，则药物敏感性越低。Di Fiore等[18]骨肉瘤细胞中分离出能够大量分泌ABCG2蛋白的肿瘤干细胞系3AB-OS，其能够使骨肉瘤细胞将化疗药物排出，并能激活大量抗细胞凋亡基因，从而有助于耐药性的产生。本实验中发现阿霉素组与对照组的ABCB1、ABCG2蛋白表达无明显差异，而片仔癀组、片仔癀与阿霉素联用可明显下调ABCB1、ABCG2蛋白的表达，说明片仔癀可以通过抑制ABC转运蛋白的表达，增加骨肉瘤干细胞裸鼠移植瘤对阿霉素敏感性，达到抑制移植瘤生长，起到逆转耐药作用。
[参考文献]
[1] Berner K，Johannesen TB，Berner A，et al. Time-trends on incidence and survival in a nationwide and unselected cohort of patients with skeletal osteosarcoma [J] Acta Oncol，2015，54（1）：25-33.
[2] Chou AJ，Gorlick R. Chemotherapy resistance in osteosarcoma：current challenges and future directions [J]. Expert Rev Anticancer Ther，2006，6（7）：1075-1085.
[3] Abarrategi A，Tornin J，Martinez-Cruzado L，et al. Osteosarcoma：Cells-of-Origin，Cancer Stem Cells，and Targeted Therapies [J]. Stem Cells Int，2016，2016：3631764.
[4] 胡蓓蓓，林峰.多藥耐药相关蛋白与骨肉瘤化疗耐药相关性[J].国际骨科学杂志，2013，34（1）：61-63.
[5] 王雅灵，闵大六.骨肉瘤化疗耐药分子机制的相关研究进展[J].癌症进展，2016，12（4）：311-315.
[6] 流小舟，黎承军，吴苏稼.肿瘤干细胞与骨肉瘤关系的研究进展[J].江苏医药，2014，40（6）：701-703.
[7] 林海英.片仔癀干预骨肉瘤干细胞ABC转运蛋白逆转耐药的机制研究[D].福州：福建中医药大学，2016.
[8] 陈炳艺，郭文韬，林嘉辉，等.片仔癀通过PI3k/Akt通路抑制人骨肉瘤耐药细胞MG63/ADM增殖[J].中华中医药杂志，2017，32（4）：1520-1524.。
[9] 司萌.骨肉瘤干细胞及其多药耐药性的体内外相关研究[D].济南：山东大学，2013.
[10] Gibbs CP，Kukekov VG，Reith JD，et al. Stem-like cells in bone sarcomas：implications for tumorigenesis [J]. Neoplasia，2005，7（11）：967-976.
[11] Gupta PB，Chaffer CL，Weinberg RA. Cancer stem cells：mirage or reality？ [J]. Nat Med，2009，15（9）：1010-1012.
[12] 赵小琴，符立梧.肿瘤干细胞耐药机制研究进展[J].中国药理学通报，2012（12）：1637-1642.
[13] 王辉，孙桂芝.孙桂芝治疗骨肉瘤经验[J].世界中医药，2012，7（1）：21-22.
[14] 林海英，刘俊宁，陈炳艺，等.片仔癀通过PI3K/Akt信号通路诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡[J].云南中医学院学报，2015，38（5）：7-11.
[15] 张燕，王琪鸿，牛素生，等.片仔癀与阿霉素联用对骨肉瘤耐药细胞增殖和凋亡的影响[J].中华中医药杂志，2015， 30（3）：705-708.
[16] Lee YH，Yang HW，Yang LC，et al. DHFR and MDR1 upregulation is associated with chemoresistance in osteosarcoma stem-like cells [J]. Oncol Lett，2017，14（1）：171-179.
[17] Gomes CM，van Paassen H，Romeo S，et al. Multidrug resistance mediated by ABC transporters in osteosarcoma cell lines：mRNA analysis and functional radiotracer studies[J]. Nucl Med Biol，2006，33（7）：831-840.
[18] Di Fiore R，Santulli A，Ferrante RD，et al. Identification and expansion of human osteosarcoma-cancer-stem cells by long-term 3-aminobenzamide treatment [J]. J Cell Physiol，2009，219（2）：301-313