转bar基因小麦大田筛选方法的建立及验证

摘要：为在田间进行有效的阳性小麦转基因植株的筛选，进行了大田环境中筛选方法的研究。用粉剂和水剂２种不同类型草胺膦作为筛选剂，以无任何遮盖、地膜覆盖、简易小拱棚覆盖和拱棚覆盖４种处理，研究其在去除非转基因植株上的效果差异。结果表明，采用水剂草胺膦比粉剂草胺膦在大田环境中更具有彻底杀灭的效果；４００　ｍｇ／Ｌ的粉剂浓度和４００　ｍｇ／Ｌ的水剂浓度在覆盖地膜时均具有较好的筛选效果，粉剂低于该浓度则不能彻底杀灭；从小麦发育的４叶１心期到拔节期均可以作为筛选的时期；比较喷施后杀灭效果，加盖拱棚＞加盖简易小拱棚＞加盖地膜＞无任何遮盖，但加盖拱棚会显著增加小麦株高；筛选结果与ＰＣＲ检测结果一致。该研究建立并验证了一个大田筛选转ｂａｒ基因小麦的方法，为小麦转基因材料作为亲本用于分子育种奠定了基础。

关键词：小麦；转ｂａｒ基因；大田筛选方法；草胺膦

中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｑ７８９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5592-04

在转基因小麦研究中，通常在转化目的基因的同时连接一个选择标记基因用于对转基因植株的筛选。据报道，目前已有５０多种标记基因用于转基因研究，常用的选择标记基因主要有ｂａｒ基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因［１，２］，其中，ＤＬ－ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ（ＰＰＴ）是转基因小麦中常用的一种选择剂，用于筛选含有ｂａｒ基因的转基因植株。草胺膦抑制植物谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）活性，造成氮代谢失调和必需氨基酸的缺乏，导致植物细胞内氨累积而中毒，而ｂａｒ基因编码ＰＰＴ乙酰转移酶（Ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ　Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＰＡＴ），该酶可以使ＰＰＴ乙酰化，从而使ＰＰＴ丧失毒性［３，４］。

以往对转基因植株的筛选，大多是采用涂抹法或在温室条件下进行［５－１０］，涂抹法在样品较少情况下可以较易进行，而对于单株数较多的育种材料来说，则会急剧加大工作量；鉴于温室条件如光照、温度、湿度均可控制，在温室条件下进行喷施或涂抹也较易进行，如果在开放大田环境中用同样的药剂、条件和方法筛选转基因植株，显然会有较大难度。而进行转基因分子育种，就必须在田间对较多的后代材料进行选择，如果不能快速准确地除掉不含目的基因的阴性单株，势必会大大加重育种人员的负担。

对于田间进行大规模筛选含有目的基因的方法还鲜有报道。针对该问题进行了小麦大田转基因植株的筛选研究。根据杨逢玉等［３］影响植物吸收除草剂的关键因素是湿度、温度和光照的研究结果，重点采取了保证温度和湿度因素的措施，进行了搭建拱棚、简易小拱棚和覆盖地膜等对比试验，并研究了试剂浓度和小麦不同发育时期对除草剂吸收的影响，最终期望摸索出一种彻底、准确杀死非转基因后代的方法，为将转基因材料应用于育种奠定坚实的基础。

１ 材料与方法

１．１ 供试材料

转高分子麦谷蛋白亚基基因１Ｄｘ５和选择标记基因ｂａｒ的小麦２－９６１５（５８－１６）和２－９６１７（ｗ１８－１１）由华中科技大学何光源教授提供。非转基因小麦材料襄麦５５和“９００６８”为华中科技大学生命科学学院实验室保存。所有材料于２０１１年１１月种植于湖北省农业科学院试验田，前茬水稻。

筛选剂采用Ｓｉｇｍａ公司草胺膦粉剂和永农生物科技有限公司的草胺膦水剂（有效成分２００　ｇ／Ｌ），分别稀释到１００、１５０、２００、２５０、４００、６００　ｍｇ／Ｌ备用。

１．２ 草胺膦喷施方法

处理方法：田间选取长势良好、整齐的样地搭建拱棚、简易拱棚和覆盖地膜。

喷施时期：从４叶１心期、５叶１心期、６叶１心期至拔节期喷施。

喷施方法：将草胺膦粉剂和水剂稀释至不同浓度，均匀喷洒在小麦叶片上，直至叶片聚集液滴为止。在晴天正午或当天温度较高时喷施，有利于对草胺膦的吸收。喷施时使用挡板隔离相邻的材料。试验以不喷施草胺膦为对照，以比较除草剂杀灭效果。喷施５　ｄ后记录叶片是否失绿变黄、萎蔫，６０　ｄ后查看整个植株是否彻底死亡。

１．３ 验证方法

ｂａｒ基因ＰＣＲ扩增方法采用张媛媛等［１１］的方法，１．５％琼脂糖凝胶电泳检测，引物序列由华大基因合成。

２ 结果与分析

２．１ 不同筛选剂类型对小麦的杀灭效果差异

通过两种除草剂对比试验结果可见，在相同浓度下，二者均能使不含ｂａｒ基因的小麦植株产生相应毒害作用，只是粉剂的效果较为短暂，并不能起到完全杀死的作用；而水剂可以完全彻底杀灭非转基因小麦，效果较明显。

２．２ 不同处理对不同时期小麦杀灭效果的影响

由于在大田中使用粉剂草胺膦喷施后未采用任何措施以保证喷施后小麦叶片的温度和湿度，使小麦表现出反应较迟钝，仅能使个别叶片黄化，之后可以恢复正常。试验比较了４种处理方式对非转基因小麦杀灭效果的影响，分别是拱棚（高１．５　ｍ）覆盖、简易小拱棚（高４０.0　ｃｍ）覆盖、地膜覆盖和无任何遮盖处理。

２．２．１ 拱棚遮盖处理 １２月１８日使用水剂草胺膦处理（１５０、２００、２５０　ｍｇ／Ｌ），能够彻底杀灭非转基因小麦。喷施后，叶片受毒害反应快，４～５　ｄ即能表现出黄化现象，６０　ｄ后能够全部死亡。

２．２．３ 地膜覆盖处理 １月９日（６叶１心期）用水剂草胺膦２００、４００、６００　ｍｇ／Ｌ处理，每个材料各喷施２行，留两行不喷施做对照，喷施完覆盖地膜。５　ｄ后除２００　ｍｇ／Ｌ浓度略有绿色外，其余浓度处理叶片均变黄，６０　ｄ后２００　ｍｇ／Ｌ浓度处理仍有几株小麦存活，而其余浓度处理小麦均全部死亡。说明４００　ｍｇ／Ｌ或以上浓度在加盖地膜情况下，可以彻底杀灭非转基因小麦植株。

２．３ 大田直接喷施结果

为了探索不做任何遮盖处理喷施水剂草胺膦对非转基因小麦的杀灭效果，使用４００　ｍｇ／Ｌ浓度喷施非转基因材料后，50%采取覆盖地膜处理，50%不做任何处理。结果覆盖了地膜的小麦全部死亡，未做任何处理的小麦大部分也全部死亡，但是反应时间较覆盖地膜的小麦迟。

２．４ 不同处理对小麦生长发育的影响

２．５ 超大剂量喷施草胺膦对转基因小麦的影响

为了考查过量使用除草剂对转基因植株鉴定的影响，试验采用正常使用剂量的６.0倍和７．５倍处理含有ｂａｒ基因的小麦材料２－９６１５和２－９６１７。结果表明，喷施后植株基部老叶叶尖逐渐变黄，最终基部约３片叶死亡，但整个植株未受大的影响，仍能正常生长，２０　ｄ后即转为正常状态。说明若过量施用了草胺膦，也不能杀死携带目标基因的植株，从而不会影响后代选择。

２．６ 筛选方法的验证

３ 讨论

３．１ 最优处理方式的确定

大田环境中温度、湿度和光照随天气变化而变化，不利于植物对除草剂的吸收，从而影响了杀灭阴性材料的效果［３］。为确保对阳性植株的选择，在喷施除草剂后加盖透明的覆盖物，以达到保温和保湿的目的。结果表明，加盖的拱棚的高度越高，植株对除草剂的反应越快，但同时对植株的株高影响也越大。只有覆盖地膜对植株高度无影响，同样能够达到较好的选择效果，同时覆盖地膜的方法简单易行，所用成本也较低，又能确保彻底杀灭阴性植株，因此建议采用喷施草胺膦后覆盖地膜而无需搭建拱棚。此外，水剂草胺膦杀灭效果显著优于粉剂草胺膦，而且成本也非常低。

３．２ 不同基因型和发育时期对草胺膦吸收的影响

就基因型而言，研究采用非转基因小麦材料和转基因材料各两个，喷施前期的反应略有差异，如叶色黄化程度，与武丽敏等［１２］的结果一致，但到后期基本无较大变化。因此，非转基因小麦和转基因小麦的不同基因型对除草剂的适用性没有较大影响。就叶龄或发育时期而言，从４叶１心期到拔节期均进行了不同浓度的试验，并未发现对草胺膦反应迟钝时期，说明这些时期均可进行草胺膦筛选试验。值得注意的是，拔节期后植株株高明显增高，不利于覆盖地膜，建议最好在拔节期前进行喷施。

参考文献：

［１］　ＭＩＫＩ　Ｂ，　ＭＣＨＵＧＨ　Ｓ．　Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ：　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ　ａｎｄ　ｂｉｏｓａｆｅｔｙ［Ｊ］．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１０７：１９３－２３２．

［２］　欧巧明，陈玉梁，张正英，等．小麦转基因技术研究进展及其在育种中的应用［Ｊ］．中国农学通报，２００５，２１（１）：４１－４５．

［３］　杨逢玉，张宏军，倪汉文．灭生性除草剂草胺膦的作用机理及其应用［Ｊ］．　北京农学院学报，２００２，１７（４）：１００－１０５．

［４］　周淼平，余桂红，任丽娟，等．转抗除草剂基因小麦植株的筛选方法研究［Ｊ］．麦类作物学报，２００８，２８（６）：９３５－９４０．

［５］　朱常香，宋云枝，张杰道，等．抗虫、抗除草剂转基因玉米的获得及遗传研究［Ｊ］．山东农业大学学报（自然科学版），２００２，３３（２）：１２０－１２５．

［６］　王才林，赵 凌，宗寿余，等．用花粉管通道法将ｂａｒ基因导入水稻获得可遗传的转基因植株［Ｊ］．江苏农业科学，２００２，１８（３）：１２９－１３３．

［７］　姚方印，李中华，李广贤．根据标记基因快速检测转基因水稻［Ｊ］．山东农业科学，２００１（３）：１９－２０．

［８］　伍成祥，宛煜嵩，徐 俊，等．基因枪转化ＭＡＲ序列介导水稻ｂａｒ基因的表达分析［Ｊ］．生物技术学报，２００２，１０（３）：２２７－２３０．

［９］　王才林，赵 凌，宗寿余，等．水稻抗除草剂基因ｂａｒ的转育研究［Ｊ］．作物学报，２００２，２８（３）：３０５－３０９．

［１０］　徐琼芳，李连城，陈 孝，等．基因枪法获得ＧＮＡ转基因小麦植株的研究［Ｊ］．中国农业科学，２００１，３４（１）：５－８．

［１１］　张媛媛，江昌俊，蒋明权．用基因枪法将抗除草剂ｂａｒ基因导入小麦的研究［Ｊ］．南京农业大学学报，２００５，２８（１）：１１－１５．

［１２］　武丽敏，魏育明，郑有良．不同基因型小麦对除草剂Ｂａｓｔａ敏感性研究［Ｊ］．麦类作物学报，２００４，２４（２）：１１８－１２０．

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