苏云金芽孢杆菌的生物防治安全性研究进展
摘要:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前全球应用最成功的生物杀虫剂之一。然而近10 年多的研究成果表明,一直以来人们认为对人畜无毒性的苏云金芽孢杆菌的安全性问题受到质疑,一些专家认为有必要通过现代生物技术对苏云金芽孢杆菌进一步改良,重新选育一些安全性更可靠、杀虫效率更高的Bt菌株应用于生物防治,以避免其对人畜的可能毒害。
关键词:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt);生物防治;安全性;遗传改良;活性成分
中图分类号:S476.1;Q936文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2485-05
Advances on the Safety of Biological Control with Bacillus thuringiensis
CAO Qiong1,NI Chao-chao2
(1. Wuhan City Vocational College, Wuhan 430064, China;
2.Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)
Abstract: Bacillus thuringiensis is one of the most successful biological insecticides applied so far in the world. However, some reports in the past ten years showed that people doubted the safety of Bacillus thuringiensis, which was considered non-toxic to human and animals. Some experts thought that it was necessary to develop new Bt strains with better safety and efficiency with modern biological technology to avoid potential toxicity to human and animals.
Key words: Bacillus thuringiensis; biological control; safety; genetic improvement; active ingredient
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称 Bt)是一类能引起昆虫致病的病原菌,1901年首次发现于日本,1938年作为生物杀虫剂成为商品。自20世纪50年代Bt商品工业化以来,就以其高效安全、对人畜没有毒性、能特异杀灭目标害虫、对自然环境也不造成污染而成为全球应用最成功的生物杀虫剂之一,也是目前研究最深入的生物杀虫剂。
目前Bt作为应用总量最大的生物杀虫剂,却只占农药总用量的2%~3%,这距离世界环境与发展大会确定的到2015年生物农药的使用将占农药总用量50%以上的要求还相差甚远,因此提升Bt生物农药的应用安全性和杀虫功效仍然具有深远的意义和研究价值。
1Bt的特性
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus,Bc)、苏云金芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌(Bacillus mycoides,Bm)、假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides,Bp)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis,Ba)以及韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis,Bw)全部归类于蜡状芽孢杆菌群。
Bt是一种在自然界广泛分布的好气性芽孢杆菌,在昆虫、土壤、储藏品及其尘埃、污水和植被上都有分布,革兰氏染色阳性。其细胞长度不到0.005 mm,当它生长到一定阶段,细胞一端会形成一个卵圆形的芽孢,用来繁殖后代,另一端会形成一个菱形或近似正方体的结晶体,因为与芽孢相伴而生被称为伴孢晶体,也称δ-内毒素[1],是一种或多种杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins,简称ICPs),有很强的杀虫毒性。
Bt的生活史为芽孢萌发-营养生长-内部形成芽孢和伴孢晶体-芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体等过程。
2Bt的活性成分
大量的研究使人们认识了越来越多的Bt的活性成分[2],特别是其非杀虫活性成分的逐一发现,使人们对Bt的认识更进一步深入。
Bt的杀虫活性成分有几丁质酶、杀虫晶体蛋白(δ-内毒素)、磷酯酶C(α-外毒素)、苏云金素(β-外毒素)、溶血素、肠毒素、营养期杀虫蛋白、芽孢等[3]。而双效菌素、辅助蛋白和自身诱导物抑制蛋白等不具有直接的杀虫活性。其具体分类情况如表1所示。
2.1营养期杀虫蛋白
营养期杀虫蛋白(VIPs)是一类Bt在营养期分泌的可溶性新型杀虫蛋白。此杀虫蛋白基因的种类仅有VIP3A(a)、VIP3A(b)和VIP-s,目前尚未定位。杀虫机理与杀虫晶体蛋白基因相似,即通过与敏感昆虫中肠上皮细胞受体结合,使中肠溶解而致死。
2.2几丁质酶
大量研究证明Bt的几丁质酶(Chitinase)本身对昆虫的毒杀作用并不明显,但是能增强杀虫晶体蛋白的杀虫作用,原因是昆虫中肠围食膜(大多数昆虫中肠内壁附着的一层起润滑和保护作用的半透性黏膜)的主要成分几丁质和蛋白质,是昆虫防治病原菌和病毒的屏障,当Bt进入其中肠后分泌的几丁质酶将围食膜破坏,然后杀虫晶体蛋白进一步作用造成中肠穿孔而导致昆虫死亡。
2.3磷酯酶C
磷酯酶C(Phospholipase C)是一类可催化磷酯C3上的磷酯酰键的蛋白水解酶,在细胞代谢和信息传递等方面起着重要作用。
Bt的磷酯酶有两种,一种是磷脂酞胆碱特异的磷脂酶(简称PCH),另一种是磷脂酞肌醇特异的磷脂酶(简称PIH),都是α-外毒素。
2.4溶血素
溶血素(Hemolysin)是一种潜在的Bt孢外致病因子,其作用是当Bt菌株附着到昆虫肠壁细胞后肠壁溃烂,菌株迅速通过淋巴系统进入血系统,分泌溶血素引起溶血作用,使昆虫患败血症而死亡,由于其过程相对缓慢,因此具有一定的潜伏性。
已经发现了很多Bt的溶血素种类,如溶血素Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、BL、溶细胞素AB和神经磷脂酶等,而在Bt中仅发现了溶血素Ⅱ。
2.5苏云金素
苏云金素(Thuringiensin)主要存在于血清型H1的Bt菌株,有H4ac、H5、H7~H12 8种,是一类腺嘌呤核苷酸衍生物,能抑制RNA聚合酶活性,在细菌生长时被分泌到细胞外,都是β-外毒素。
苏云金素对蝇类有很强的毒力,作用过程缓慢,作用机制发生在昆虫蜕皮和变态阶段,这两个阶段RNA合成旺盛,苏云金素通过抑制RNA聚合酶活性,阻断DNA的表达,对人类和动物有一定的毒性。
2.6双效菌素
双效菌素(Zwitternicin)是一种氨基多元醇类广谱抗生素,苏云金亚种、库斯塔克亚种等17种不同的亚种均能产生双效菌素。其主要作用是抑制霉菌的生长繁殖,在霉菌还没侵染植物前,喷施双效菌素可起到预防植物病害的作用,此外,双效菌素对Bt的杀虫活性还具有一定的增效作用。
2.7杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal protein, ICPs)
杀虫晶体蛋白是Bt杀虫的主要毒素成分,又叫δ-内毒素[4]。
2.7.1杀虫晶体蛋白的种类杀虫晶体蛋白的种类繁多,目前已知并命名的有230多种。其中大多数是Cry蛋白,对鳞翅目、双翅目或鞘翅目幼虫有毒;少数是Cyt蛋白,活体条件下只对双翅目幼虫有较弱的毒性,离体条件下具有广谱性毒性[5]。
用于防治鳞翅目害虫杀虫剂的主要来自库斯塔克亚种(Subsp kurstaki)、苏云金亚种(Subsp thuring
iensis)和鲇泽亚种(Subsp aizawai)的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac三个高毒力晶体蛋白基因,其中Cry1Ac杀虫毒力最强,来自鲇泽亚种;拟步行甲亚种(Subsp. tenebrionis)的杀虫蛋白Cry3A对鞘翅目马铃薯甲虫(Leptinotarsa decenlineata)具有较强的毒力;来自日本亚种(Subsp japonensis)的Cry8C杀虫晶体蛋白对鞘翅目金龟子类幼虫有杀虫毒力;以色列亚种(Subsp istealeosis)的杀虫蛋白至少有Cry4A、Cry4B、Cry11A和Cyt1A四种,能杀死蚊蚋幼虫,其中Cry11A的活性最高,除了具有抗双翅目昆虫活性外,还具有溶解无脊椎动物和脊椎动物细胞的活性;1999年日本的Mizuki等[6]发现了某些没有杀虫能力的81kD伴孢晶体蛋白,水解活化后对体外培养的人类白血病T细胞和人类子宫颈癌细胞具有杀伤能力,该蛋白的基因是Cry31Aal,这是继发现以色列亚种后又一个与医学相关的基因,有望为抗癌研究的发展和生物制药开辟新的方向;近年来发现了一些与Bt具有一定同源性的杀虫晶体蛋白基因如Cryl8Aal,它与Cry2A具有40%的相似性,来自金龟子芽孢杆菌(Baoillus popilliae),这是一类对金龟子幼虫专性寄生的细菌,以后又陆续发现了Cry18Ba和Cry18Ca。
2.7.2杀虫晶体蛋白的作用过程和基因定位杀虫晶体蛋白被昆虫取食后,迅速作用于昆虫的中肠,致使肠壁出现微孔,昆虫立刻停止取食,肠道内膜很快遭到破坏,Bt菌株穿过肠道进入血淋巴系统和血系统,最后昆虫因饥饿和败血症而死亡[7,8]。
大量研究证明了编码杀虫晶体蛋白(ICPs)的结构基因和调节基因主要位于大质粒上,只有少数位于染色体上[9,10]。
2.8免疫抑制因子A
Bt的免疫抑制因子A(Immune inhibitor A, InA)是一种能产生免疫反应,引起生物体致病的酶类活性因子,能够分解寄主产生的抗菌蛋白,通过消化免疫球蛋白IgG和IgA引起寄主致病作用。
2.9肠毒素
肠毒素(Enterotoxin)是引起食物中毒的致病物质,是一类水溶性蛋白质,食品中的肠毒素不因热加工而灭活,对蛋白酶也有耐性,故在消化道中不易被破坏。
目前已发现了3种肠毒素:无溶血肠毒素NHE、溶血肠毒素HBL和枯草杆菌毒素T,只有HBL具有溶血活性。研究证实Bt的库斯塔克亚种和以色列亚种的商业菌株中含有肠毒素基因并且具有溶血活性,只是目前尚未见肠毒素影响人类健康的报道。
2.10辅助蛋白
辅助蛋白(Help protein)能促进杀虫晶体蛋白的杀虫作用,也可能是以分子伴侣的形式参与杀虫晶体蛋白的构成,对稳定杀虫晶体蛋白的结构有作用。
2.11自身诱导物抑制蛋白
自身诱导物是一类存在于植物的病原菌细胞间传递信息的信号分子,当自身诱导物达到一定浓度时,就能激活病原菌中某些特殊毒素基因的表达,促使病原菌对植物产生致病作用。
有研究表明,在Bt菌株中存在一种抑制蛋白,能抑制病原菌细胞内的自身诱导物,这种抑制蛋白被称为自身诱导物抑制蛋白。它是一种孢内活性成分,影响病原菌致病的作用原理可能是由于降低了病原菌细胞内自身诱导物的浓度,而使自身诱导物达不到激活某些特殊毒素基因表达的水平。
2.12芽孢
芽孢是Bt的繁殖结构。很多研究表明,芽孢本身对昆虫的毒力很低,只有通过与杀虫晶体蛋白协同作用才能达到杀虫效果。芽孢杀虫机理是在伴孢晶体使中肠溃疡后,芽孢进入血系统萌发并生长,在生长过程中产生的多种外毒素及酶使幼虫患败血症而致死。
3Bt在农林业中的广泛应用
为了减少虫害,确保粮食产量,每年全世界要使用200多万t的化学农药,金额高达160亿美元。然而,大量使用化学农药会带来许多忧虑,如生态平衡的破坏,引起人畜中毒,长期使用昆虫还会产生抗药性,使化学农药的用量越来越大等问题[11,12]。
与化学农药相比,生物杀虫剂具有低成本、高效安全、对目标害虫的特异性、对人畜无毒性等特性,对自然界也不造成污染。Bt作为生物杀虫剂应用于农林业生产已经有几十年的历史。迄今为止已鉴定了Bt的70个血清型,83个亚种,其中我国发现41个血清型。它对无脊椎动物中的4个门,线形动物门、原生动物门、扁形动物门中某些有害种类和节肢动物中的10个目(如鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、直翅目、等翅目、蜚螺目、毛翅目和蚤目等)的近600多种昆虫有特异活性。
我国研究和应用Bt始于1959年;1965年进行了工业化生产;自20世纪80年代以来,我国Bt规模进一步扩大,目前已经成为主要的生物杀虫剂[11]。我国对Bt有敏感特异的昆虫在125种以上。
4Bt的安全性分析和遗传改良
4.1Bt的安全性分析
4.1.1对生态系统的影响Bt的广泛使用会杀死大量对作物无害甚至是对环境有益的昆虫,这些昆虫对生态系统的结构和功能是非常重要的。例如,很多鸟类以昆虫的幼虫为食,Bt的广泛使用会导致这些地区鸟的种类和分布减少;未降解的Bt制剂流入水域,也会引起水生动物的中毒或致死。
4.1.2对人和哺乳动物的影响一直以来人们都认为Bt在生物防治中对人和哺乳动物没有危害,之所以这样认为可能有两个原因,一是Bt肠毒素基因与Bc肠毒素基因有差异,使得Bt肠毒素的致病性低于Bc肠毒素;另一原因可能是Bt菌株引起的一些感染特征与Bc引起的感染特征相似而被误检为Bc。
随着对Bt研究的逐步深入,其活性成分逐渐知晓,特别是其非杀虫活性成分的发现,如溶血素(Hemolysin)、苏云金素(Thuringiensin)、免疫抑制因子A(InA)、肠毒素(Enterotoxin)等,使人们对Bt有了新的认识,有些Bt菌株对人和哺乳动物也可能存在毒性。近来有研究表明,Bt与Bc和Ba之间有着很近的亲缘关系,同源程度很高,有试验表明Bt、Bc和Ba的很多基因的同源性在95%以上,在临床上最常见的危害是导致食物中毒,也可能引起脓肿、脑膜炎、骨髓炎、心膜炎等,从而使科学家担心其大量使用的安全可靠性。已有研究发现,在有些Bt商品中含有类似的能引起人畜条件致病的活性成分,如库斯塔克亚种和以色列亚种的商业菌株中含有肠毒素基因并具有溶血活性[13,14]。并且在临床感染的组织中也分离出了Bt菌株,但是,未被证明是否具有感染能力。还有,杀虫质粒和其上的人致病毒素基因在不同菌株之间可以以很低的频率互相转移,这也增加了Bt对人畜的潜在危险性[15,16]。
鉴于以上事实,特别是Bt对人和哺乳动物的毒性,致使有些科学家提出Bt对人畜的安全性有待进一步提升,因此有必要重新选育一些安全性更可靠、杀虫效率更高的Bt菌株应用于生物防治,以避免其对人的可能毒性。
4.2Bt的遗传改良
从自然环境中很难直接分离出不含肠毒素基因,且不产生肠毒素溶血活性同时又具有高效杀虫质粒的Bt菌株。接合转移是一种新的遗传改良方式,是通过基因剔除使Bt的病原因子失活或选择不含肠毒素基因无溶血活性的Bt或Bc宿主菌,导入高效杀虫质粒进行遗传改良,从而筛选出一些既无致病危害又保留高效杀虫毒力的重组菌株。2003年Yang等[17]把Cry1Ac基因转移到一个没有溶血活性的库斯塔克亚种中,结果获得的新菌株的杀虫活性与原来的库斯塔克亚种亲本菌株的杀虫活性几乎一样。
经过多年的研究积累,Bt的遗传改良工作取得了以下成果。
改良出蜡状芽孢杆菌DBt248,其不含溶血素hbl基因、非溶血素nhe基因、病原调控因子plcR和pXO1-ORF101相似片断,因而没有溶血活性,有望作为宿主菌用于苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的表达以构建安全高效的杀虫工程菌株[18]。
含有杀虫晶体蛋白基因cry1Ac的高效杀虫质粒pHT73能以自然接合转移的方式转移到两株库斯塔克亚种、1株覃状芽孢杆菌、5株蜡状芽孢杆菌和1株不含致病因子的达姆斯特变种中。接合子菌株能表达相应的杀虫晶体蛋白。有试验证明pHT73质粒在库斯塔克亚种中的转移率较高[18]。
将编码有多种杀虫毒素基因的大质粒pBtoxis接合转移至蜡状芽孢杆菌群菌株间,发现pBtoxis的宿主范围比pHT73窄,转移效率也较低,只有10-8接合子/受体,而且必须在接合辅助质粒的帮助下发生转移。pBtoxis能在芽孢形成期表达多种毒素蛋白[18]。
将无肠毒素基因不产生无肠毒素活性的蜡状芽孢杆菌导入pBtoxis质粒或pHT73质粒后,接合子也无溶血性。研究表明,用无肠毒素基因不产生无肠毒素活性的蜡状芽孢杆菌作为宿主菌,以接合转移的方式构建安全的Bt工程菌的设想是可行的[18]。
plcR基因是一种调控基因,能调控溶血素基因、肠毒素基因等基因的活性。用插入失活的方式破坏plcR基因可以使以色列亚种AND672的溶血活性降低。plcR基因的失活不影响杀虫蛋白基因的表达,也不影响其杀虫活性[18]。
以HD-1为初始诱变株经紫外线、亚硝基胍、N+离子等注入诱变,筛选出5株对棉铃虫有高毒力的诱变株,B47、B28、S159、B209和S218,其毒力分别提升87%、140%、87%、92%和100%,传代10代后其毒力没有明显下降[19]。
另外,利用基因工程技术,任何生物体都可以获得并表达Cry杀虫晶体蛋白,这也是Bt遗传改良的又一方向。近30年来,随着转Bt基因作物[20-22](转Bt基因番茄、转Bt基因烟草、转Bt基因棉花、转Bt基因水稻以及转Bt基因玉米等)的不断问世,Bt在生物防治方面的推广速度和效果使农林业的发展进入了新的产业化阶段。
以上成果说明,将现代分子生物学技术应用于Bt菌株的遗传改良,可以很好地提高其杀虫活性和安全性。
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