羧基化壳寡糖络合碘CCOS—I对水稻纹枯病菌的抑制作用及机理初讨
对照药剂，测定CCOS-I对水稻纹枯病菌的室内抑菌效果和田间防效，以及对超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、叶片过氧化物酶（peroridase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase）等相关防御酶活性的影响。结果表明：羧基化壳寡糖络合碘对该病菌抑制效果明显，经室内毒力测定，其EC50值12.22 mg/L，明显高于对照药剂20%井冈霉素粉剂。田间药效试验结果表明，在水稻第3次用药后14 d，100 g/hm2的羧基化壳寡糖络合碘防效达到80.66%，与井冈霉素有效剂量150 g/hm2的效果相当，优于同剂量井冈霉素处理。CCOS-I在试验剂量范围内对水稻纹枯病有很好的防治作用，且对水稻生长无任何药害现在发生，可以诱导水稻相关防御酶活性提高，适用于水稻纹枯病的防治，具有一定的开发推广价值。
关键词 水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）；羧基化壳寡糖络合碘（CCOS-I）；抑菌作用；防御酶；防治效果
中图分类号 S482.2 文献标识码 A
Abstract In order to clarify the preventive and therapeutic effects on rice sheath blight， 20% validamycin wettable powder as the control， the antibacterial effect of carboxylated chitosan oligosaccharide iodine complex （CCOS-I） on R.solani in a greenhouse and its efficacy in the paddy field were assayed. And the induced activity of CCOS-I on the peroxidase （POD）， superoxide dismutase （SOD）， polyphenol oxidase （PPO）， phenylalnaine ammonia-lyase （PAL） and beta-1，3-glucanase （beta-1，3-glucanase） were studied. CCOS-I had a significant inhibitory effect on R. solani， and its EC50 value was 12.22 mg/L， which was obviously higher than that of the control in the field trial test， The control effect of CCOS-I at the effective dose of 100 g/hm2 was 80.66%，which was equivalent to the valid dose of validamycin 150 g/hm2 and better than the same dose of validamycin，after the third spraying 14 d. Compared with the spraying control agent， CCOS-I not only had good control effect on rice sheath blight， but also had a certain promoting effect on rice growth. CCOS-I induced rice resistance against R. solani which related to the increased activities of defense enzymes caused by CCOS-I. CCOS-I was safe for rice and had a certain value of development and promotion.
Keywords rice sheath blight （Rhizoctonia solani）； carboxyl chitosan oligosaccharide complex iodine （CCOS-I）； antimicrobial activity； defense enzymes； control effect
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.018
水稻紋枯病是立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的一种水稻真菌病害，多在高温、高湿环境下发生，在南方稻区尤为严重，是当前水稻生产上的主要病害之一[1]，纹枯病可造成水稻谷粒不饱满，空壳率增加甚至引起植株倒伏枯死，造成水稻减产10%～50%以上[2]。针对水稻纹枯病，国内外开展了室内及田间药效试验研究[3-10]。目前，生产上用于防治纹枯病的化学药剂主要有噻氟酰胺、三唑酮、苯醚·丙环唑、多菌灵、甲基硫菌灵等[11-12]。然而，随着这些杀菌剂的高频率、单一性、连续性使用，使得立枯丝核菌产生了抗药性，从而导致防治效果下降。同时，由于化学农药存在药物残留、难以降解、危害环境等问题，近年来，针对水稻纹枯病的生物农药由于具有安全性高、环境相容性好等优点而成为广大科研工作者的研究热点。
壳寡糖（COS）是壳聚糖经过降解以后得到的聚合度为2～20的产物，作为一种激发子，可以成为植物细胞的信号分子，刺激植物免疫系统，激活防御反应，促使植物产生抗病害的活性物质抑制病害，并促进植物生长[13-14]。但是由于其作用表达过程较慢，从开始喷施到农药杀死或击倒靶标有害生物所需时间的较长，速效性差，影响了寡糖类农药产业发展的步伐。羧基化壳寡糖是壳寡糖分子第六位羟基羧基化后生成的一种寡糖衍生物，分子中含有丰富的-OH、-NH2和-COOH基团，除具有壳寡糖相似生理功能外，还能有效提高壳寡糖络合能力，利用该分子特性，与具有较强杀菌能力的碘元素形成稳定的络合体系，制备出羧基壳寡糖络合碘，以期充分发挥寡糖植物生理调节、诱导植物产生抗病抗逆性等防卫反应功能以及碘元素对植物病原菌的速杀作用，羧基化壳寡糖络合碘（CCOS-I）作为本实验室研发的新型抗菌制剂，还没有将其应用于水稻纹枯病的报道，本研究通过室内盆栽实验及田间药效试验，评价其对水稻纹枯病的抑制作用及相关防御酶活性的影响，为寡糖衍生物药剂的研究、开发和应用开拓新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试药剂 壳寡糖络合碘（CCOS-I），由上海贯发海洋生物科技有限公司提供；20%井冈霉素粉剂，由上海源叶生物科技有限公司提供。
1.1.2 供试菌株 立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），由中国农业大学植物病理学系提供。
1.1.3 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基制备：马铃薯200 g去皮切块，加1 000 mL无菌水煮沸30 min，用八层纱布过滤，加入琼脂15 g，加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，加入葡萄糖20 g融化后，稍冷却后补足无菌水至1 000 mL，分装于试管中灭菌（121 ℃，20 min），冷却后贮存备用。
含药培养基平板的制备：吸取1 mL各个质量浓度的药液，与PDA培养基以1：9比例混匀后分别倒入5个培养皿内，制成系列质量浓度的含药培养基（CCOS-I质量分数分别为120、60、30、15、7.5 mg/L；井冈霉素质量分数为：120、60、30、15、7.5 mg/L），同时设置不含药平板作空白对照，每处理重复3次。
1.1.4 主要仪器 124S-CW电子天平，德国Satorious公司；ZGZ-L光照培养箱，上海丙林电子科技有限公司；新加坡“利农牌”DF400型可控压手动喷雾器。
1.2 方法
1.2.1 CCOS-I对立枯丝核菌菌丝生长的影响[15]
无菌条件下用直径5 mm的灭菌打孔器沿已培养好的菌落边缘切取菌饼，用无菌接种器将菌饼接种于不同处理培养基平板的中央，有菌丝一面朝下，置于25 ℃下暗培养10 d，待对照菌落直径长至大于平皿直径2/3时，用卡尺测量菌落直径（mm）。每个菌落用十字交叉法垂直测量直径各1次，取其平均值。与对照比较计算各药剂处理对菌落扩展的生长抑制率。以药剂质量浓度的对数值为横坐标、菌丝生长抑制率的几率值为纵坐标，采用回归分析法对试验数据进行分析，计算各处理的EC50值。
菌丝生长抑制率（%）=
1.2.2 CCOS-I对立枯丝核菌菌核形成及萌发的影响 参照张建中等[16]的方法，略有改动。将PDA培养基上培养的立枯丝核菌打成菌饼（d= 5 mm），分别接种在含药培养基（CCOS-I质量分数和井冈霉素质量分数分别为120、60、30、15、7.5、0 mg/L）系列浓度的PDA平板上，25 ℃黑暗培养30 d，菌核变褐成熟时用镊子挑出收集，烘干，称重。每处理重复3 次，计算不同浓度药剂对菌核形成的抑制率。将立枯丝核菌在PDA平板上培养的成熟菌核浸渍在分别含CCOS-I和井冈霉素120、60、30、15、7.5、0 mg/L系列浓度的溶液中30 s，风干后置于PDA平板上，25 ℃培养。观察不同处理的菌核萌发情况，实验分别重复3次，每个重复测定60个菌核。
1.2.3 壳寡糖对水稻相关防卫酶活性变化的影响
1.2.2节中筛选出的CCOS-I最佳浓度喷雾处理成株期水稻植株，24 h后在喷药植株上采用喷雾法接种孢子浓度为105 CFU/mL的立枯丝核菌。试验设有3个处理：（1）喷施最优药剂后接种；（2）喷施相同剂量井冈霉素后接种；（3）喷洒无菌水后接种，每个处理3次重复。于接种后第0、1、2、3、4、5 d分别采收处理叶片样品，装入锡箔纸中，做好标记，在–80 ℃冰箱中保存备用。
POD活性测定：采用武彦霞等[17]的方法，以1 min内引起OD470、OD290变化0.01的酶量为1个酶活性单位。PPO活性测定：参照王小青等[18]的方法，以OD490值变化0.01为1个酶活单位。SOD酶活性测定：参照萧浪涛[19]的方法，略有修改；以1 h内引起OD560值变化0.01为1个酶活单位。PAL酶活性测定：参考肖仲久等[20]方法，以1 h内引起OD290变化0.01为1个酶活性单位。β-1，3-葡聚糖酶活性测定：参考Joostem等[21]的方法，以1 h生成1 μg的葡萄糖为1个酶活性单位。
1.2.4 田间药效试验 2015年8—10月在福建省龙岩市上杭县临城镇龙翔村进行，该地区常年水稻纹枯病发生较重。试验地为壤质土，有机质含量一般。供试水稻品种为广两优676。以行距20 cm，株距20 cm种植，正常肥水管理.实验药剂处理设置为：CCOS-I制剂有效剂量为50、100、150 g/hm2，对照药剂20%井冈霉素水溶性粉剂有效剂量为150 g/hm2和清水对照共5个处理，每个处理重复4 次，共20个小区，小区面积为20 m2，随机区组排列。每个小区四周设保护行，避免施药时药剂相互干扰。于水稻分蘖末期第1 次用药，间隔20 d，在水稻破口前第2次用藥，间隔10 d后在水稻齐穗期第3 次用药，每次用药量为750 L/hm2。试验期间不再喷施其他药剂，其他按常规进行田间管理。分别于第2、3 次用药后14 d，每小区随机五点取样200株水稻，调查病情，计算病情指数和防效。
水稻纹枯病病情分级参照《农药田间药效试验准则》[22]进行调查，并计算病情指数，和防治效果。
1.3 数据统计
采用Excel软件统计病情指数，采用DPS 7.05软件计算药剂对立枯丝核菌菌丝生长、孢子萌发及芽管伸长的毒力回归方程、EC50值。田间药效试验数据采用Duncan新复极差法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 CCOS-I菌丝生长的影响
CCOS-I和井冈霉素抑制立枯丝核菌菌株的回归方程及EC50值见表1。结果表明，CCOS-I对水稻纹枯病菌菌丝具有明显的抑制活性，其EC50值为12.22 mg/L，毒力高于对照药剂井冈霉素。
2.2 CCOS-I对立枯丝核菌菌核形成及其萌发的影响
在7.5～60 mg/L剂量范围内，CCOS-I对菌核形成的抑制作用随药剂浓度的升高而增强，分别高出相同剂量井冈霉素处理的56.52%、25.98%、18.84%、8.33%（图1），其中60 mg/L剂量CCOS-I对立枯丝核菌菌核产量抑制效果最为明显，抑制率达到71%，当浓度增加到120 mg/L，其菌丝生长抑制率有所下降，但与60 mg/L剂量处理效果差异不显著（p>0.05）。经观察，菌核经CCOS-I处理后，与对照相比，菌核萌发受到一定影响，菌丝的生长受到明显抑制。
2.3 CCOS-I对水稻相关防卫酶活性变化的影响
（1）SOD活性变化：不同处理后水稻叶片中SOD活性变化测定结果表明，在整个取样时间
内，CCOS-I处理叶片的SOD活性均高于井冈霉素和CK处理（图2-A）。处理后2 d，接种叶片中SOD含量达到峰值，比同剂量井冈霉素处理高出36.75%，比CK处理高出47.60%。
（2）POD活性变化：不同处理后水稻叶片中POD活性变化测定结果表明，CCOS-I和井冈霉素处理均可显著提高接种水稻叶片POD酶活性，且在处理24 h后SOD含量达到峰值，CCOS-I处理叶片中PPO酶活性分别高出井冈霉素和CK处理20.46%和32.61%（图2-B）。
（3）PPO活性变化：由图2-C可以看出，经CCOS-I处理叶片后，PPO活性明显高于井冈霉素和CK处理，在接种后24 h达到峰值，比井冈霉素和CK处理提前了1 d。且其最大值分别高出井冈霉素和CK处理24.01%和43.75%。
（4）PAL活性变化：由图2-D可以看出，经CCOS-I处理后的PAL酶活性迅速上升，且整个测定期内CCOS-I处理的水稻叶片PAL酶活性均高于两个对照处理，CCOS-I和井冈霉素处理在接种后的第1 d、第3 d呈现两个高峰，其中CCOS-I处理的2个高峰值分别高于井冈霉素处理24.42%和19.18%，而CK处理在接种后0～5 d内PAL酶活性变化不明显。
（5）β-1，3-葡聚糖酶活性变化：不同处理后水稻叶片中β-1，3-葡聚糖酶活性变化测定结果表明，处理期间CCOS-I对其影响最为显著，在接种处理后第3 d达到高峰值，其活性高于井冈霉素处理13.55%，而CK处理β-1，3葡聚糖酶活性变化相对稳定，始终低于CCOS-I和井冈霉素处理（图2-E）。
2.3 药剂的田间试验效果
由表2可以看出，CCOS-I对水稻纹枯病具有很好的防治效果，且具有一定的量效关系，随着寡聚酸碘浓度的升高，对水稻纹枯病的防治效果明显升高。在水稻第3次用药后14 d，100 g/hm2的CCOS-I防效达到各处理对水稻纹枯病的防治达到80.66%，与井冈霉素有效剂量150 g/hm2的效果相当，无显著性差异（p>0.05）。
2.4 CCOS-I的安全性调查
在3次施药后，观察水稻植株的生长状况，结果显示，CCOS-I制剂在有效剂量为50、100、150 g/hm2剂量下，各小区供试水稻植株对CCOS-I表现出较强的耐药性，生长正常，无药害发生。表明CCOS-I在所试各药量下对水稻生产安全。且CCOS-I稀释液各剂量处理与井冈霉素和清水对照相比，水稻生长性状良好，长势旺盛。表明CCOS-I在适当的施药条件下，不仅对水稻纹枯病具有良好的防治效果，且可一定程度上促进水稻生长。
3 讨论
CCOS-I作为新型壳低聚糖基配合物，属于生物源类农药，存在多种活性功能基团如-OH、-NH2、-COOH、碘离子等，可协同发挥抑菌及诱导植物抗病等防卫反应作用，本研究通过带毒培养基-菌丝生长速率法测定其对水稻纹枯病病菌的抑制效果，结果表明，（1）CCOS-I對该病菌抑制效果明显，经室内毒力测定，其EC50值12.22 mg/L，明显高于对照药剂20%井冈霉素粉剂，且CCOS-I处理对立枯丝核菌菌核形成具有强烈的抑制效果，同时对其萌发也有一定的抑制作用；而丙环唑等传统药剂对立枯丝核菌菌核萌发无抑制作用[12]，壳寡糖对水稻菌核形成和菌丝萌发均无抑制作用[23]，由此推断，可能是CCOS-I中的碘
元素在抑制立枯丝核菌菌核形成和萌发方面起着重要作用，但其机理有待进一步的研究。（2）大量研究表明，寡糖及寡糖衍生物可诱导SOD、PPO、POD、PAL以及β-1，3-葡聚糖酶等植物体内重要防御酶的活性[24-28]。本研究结果表明，经CCOS-I处理后，水稻植株体内SOD、PPD、POD、PAL和β-1，3-葡聚糖酶活性均有明显增加，且效果优于井冈霉素和CK处理。而以上几种酶等作为植物体重要的防御酶类在提高植物抗逆性、抗病性方面起着重要作用[29-31]，因此推测，CCOS-I中的壳寡糖醛酸基，本身作为壳寡糖衍生物，可诱导植物这一系列酶活性的提高，而这可能是其生物防治作用的机制之一。（3）田间药效试验结果表明，在水稻第3次用药后14 d，100 g/hm2的CCOS-I对水稻纹枯病的防治达到80.66%，与井冈霉素有效剂量150 g/hm2的效果相当，优于同剂量井冈霉素处理，对纹枯病具有良好的治疗效果。科学地掌握药剂使用时间，可以有效预防水稻纹枯病的发生、促进水稻生长、且该制剂对环境污染小，安全、高效，是防治水稻纹枯病的良好药剂。
致 谢 感谢福建省农业科学院植物保护研究所的陈福如老师在田间药效试验中的指导和帮助。
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