道真玄参白绢病病原鉴定及杀菌剂毒力测定
摘要：通过对被侵染的道真玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）植株病症、病状的观察，及白绢病病菌的培养性状与菌落形态等的研究，结合ITS序列分析，最终确定该致病菌为整齐小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.），又名罗氏白绢小菌核菌。室内杀菌剂抑菌试验结果表明，10%多抗霉素对整齐小核菌有较好的抑制作用。
关键词：道真；玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）；整齐小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）；杀菌剂；毒力测定
中图分类号：S432.4+4；S482.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-5020-02
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.023
Identification and Fungicide Toxicity Determination of the Sclerotium rolfsii Sacc.
On Scrophularia ningpoensis Hemsl. In Daozhen
CHEN Jing， SANG Wei-jun
（College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， China）
Abstract： Through observation symptoms of Daozhen figwort root （Scrophularia ningpoensis Hemsl.），and researching southern blight of pathogens to cultivate character and colony morphology， combined with ITS sequence analysis， finally the plant pathogenic bacteria was determined as Sclerotium rolfsii Sacc.， also known as roche white silk small sclerotium bacteria. The indoor bacteriostatic test results showed that polyoxins was the best inhabitant against S. rolfsii Sacc.
Key words： Daozhen； Scrophularia ningpoensis Hemsl.； Sclerotium rolfsii Sacc.； fungicide； toxicity determination
玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）是著名的传统中药，始载于《神农本草经疏》[1]。又称元参、黑参、浙玄参，属玄参科（Scrophulariaceae）多年生深根性草本药用植物，以其干燥块根入药，味甘、苦、咸，性微寒，具有凉血滋阴、泻火解毒的功效[2]。道真县是贵州省玄参主要产区，常年种植面积达几百公顷，生产的玄参以其有效成分含量高、品质好、加工独特而行销国内外。调查发现，道真玄参种植基地常有玄参白绢病发生，对道真玄参的生产造成较大的影响。目前国内外鲜见道真玄参白绢病防治的报道，为了有效防治该病害的发生及危害，本研究将微生物学和分子生物学rDNA-ITS序列分析鉴定结合起来，对该病病原菌种属进行了较精确的定位，并筛选了几种较新的杀菌剂对道真玄参白绢病菌菌丝体生长的影响进行试验，旨在为生产中应用杀菌剂防治白绢病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试病原物寄主为受害玄参标本，采集于贵州省道真县阳溪镇玄参种植基地。
供试试剂：DNA提取试剂盒，rDNA-ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′）﹑ITS4（5′-TCCTCCGCTTAGATATGC-3′），2×Taq PCR MasterMix[生工生物工程（上海）股份有限公司]。
供试药剂：3%中生菌素可湿性粉剂（陕西标正作物科学有限公司），18.7%丙环·嘧菌酯乳悬剂（瑞士先正达作物保护有限公司），10%多抗霉素可湿性粉剂（山东神星药业有限公司），20%乙酸铜可湿性粉剂（山东科大创业生物有限公司），0.3%丁子香酚可溶液剂（保定市亚达化工有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 病原物的分离培养 采用组织分离法。在感病变色处切取病健交界约5 mm的组织，用体积分数为70%的乙醇消毒5 s，再用0.1% HgCl2消毒2～4 min，移至灭菌水中漂洗3次以上，将其接至PDA培养基培养。后将病原菌进行3次纯化，获得纯培养菌株。
1.2.2 病原物的培养性状观察 将纯培养菌株在PDA培养基上培养，观察其菌落形态、色泽，测量其生长速度以及菌核大小。用光学显微镜观察菌丝形态、菌核剖面等，拍照保存，以供后续研究。
1.2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析 采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取该病原菌DNA，得到的DNA提取液用于PCR扩增。PCR反应体系共25 μL：模版DNA 1 μL，ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）1 μL，ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）1 μL， ddH2O 9.5 μL，Taq PCR MasterMix 12.5 μL。RCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
用1.2%琼脂糖凝胶进行PCR扩增产物电泳检测，在凝胶成像系统下观察﹑拍照。经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离该扩增产物，在紫外灯的照射下，从凝胶中切取目的条带，经DNA片段回收试剂盒纯化后，由北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。测得序列提交到GenBank数据库，用Blast与已知序列进行同源性比对。根据同源性分析，结合病原菌形态学特征，鉴定道真玄参白绢病病原菌归属。
1.2.4 室内毒力测定 采用生长速率测定法。在培养皿中分别加入9 mL培养基，1 mL稀释成不同浓度的杀菌剂，制成PDA含药培养基，对照加无菌水，每个处理3次重复，待冷却后接入白绢病菌菌饼（直径5 mm），培养皿直径为9 cm。将病原菌培养5 d后用十字交叉法分别测量每个培养皿中菌落的直径，计算对病菌的相对抑制率。
抑制率=（对照菌落直径-药剂处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%
本研究采用农药室内生物测定数据处理系统（武汉市蔬菜科学研究所﹑农业部农药检定所）进行数据统计。该处理系统中，纵坐标由抑制率转化成的抑制几率值表示，横坐标由药剂浓度转换的对数值表示，根据抑制率进行几率值（y）与杀菌剂浓度对数值（x）之间的线性回归关系分析，求得毒力回归方程、抑制中浓度EC50及相关系数r[3]。
2 结果与分析
2.1 病菌的培养性状及形态观察
菌株在PDA培养基上培养5～6 d（25 ℃）后，形成具白色、羽毛状菌丝的圆形菌落，菌丝疏松或集结成线形紧贴于基物上。培养11～12 d后形成菌核，菌核表生，球形或椭圆形，初白色，继变淡褐色，最后变红褐色，内部灰白色，表面光滑，有光泽，直径1～2 mm。根据菌落、菌丝、菌核的形态进行初步鉴定， 确定其符合整齐小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）的形态特征[4，5]。
2.2 病原菌rDNA-ITS 序列分析
将病原菌基因组DNA经通用引物ITS1-ITS4进行扩增，得到689个碱基，测序后得到其基因序列如下：
TTCTTGAAAAAGCAGGCTAGTTATCGTCGAGGTCA
ATGGTCAATATATGCACTTATATGCTAGATATATG
CGCATGATTTTATAAGTAGTGCATAAAGCTAGAAT
CCCCTTCGGGTTTGGGCGTAAACTTTTATCCCCCCA
CCCGTAGGCTTTTCTACTTGTCCAACTAATATTTTT
AAAAAAAGCCAGTCAAAATATACTCTAACCAGCT
CCTCTCTCATCCAAGCCTTGAAAAATACAAAAATT
TGTGAGGTTGATAATTTGATGACTCTCAAACAGGG
ATGCCCCTCGGAATACCAGGGGGCGGGAGGTGCG
TTCAAAGATTCGATGATTCGCTGGATTCTGCAATT
CTTATTACTTATCGCATTTCGCTGCTTCTTCATCGA
TGCAAGAGCCAAAACATCCGTTGTTGAAAGTTGTT
TATTTTTTAATTAAAAAAAACTTGAAAAAAACAAA
GTTTCAATATAAAATCGTTCTATGTAACATACAAT
AAAAGTTATATAGGGAGATCATAGTTAGAATTTCT
CCTGACTACAGTTGGTTCACAGGGGTATATATAA
TATAGCTCCAAAGGGTGCACATGCAATATTCATTA
CCACCACACCTCCTTCGCATATATAAATTCAATAA
TGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGT
TACATTTTTTTTTTTTCCAA
将基因序列用GenBank数据库中的Blast功能进行比对分析，结果显示，与Athelia rolfsii（GenBank accession：JN017199.1）的ITS序列的同源性最高，达到95%。
根据病原菌的微生物形态特征和ITS序列同源性比较结果，确认道真玄参白绢病的病原为整齐小核菌的有性态A. rolfsii。
2.3 室内毒力测定
室内毒力测定结果（表1）表明，5种供试杀菌剂对菌丝生长的抑制作用与药剂浓度均呈正相关，其中18.7%丙环·嘧菌酯、0.3%丁子香酚、10%多抗霉素对病菌有明显的抑制作用，其EC50分别为1.179 3、0.337 0、0.024 6 μg/mL，10%多抗霉素对整齐小核菌菌丝的抑制效果最好。
3 小结与讨论
整齐小核菌作为一种常见植物病原真菌，通常仅依据其形态学特征进行病原菌种属鉴定。但有学者认为仅根据形态学特征进行菌种的鉴定与分类会出现不精确现象[6]。本研究在传统微生物形态学特征的基础上，同时进行贵州省道真玄参白绢病病原菌的rDNA-ITS序列分析和比对，从分子水平上的进一步鉴定结果可知，引起道真玄参白绢病的病原菌为整齐小核菌。试验表明，18.7%丙环·嘧菌酯、0.3%丁子香酚、10%多抗霉素对道真玄参白绢病菌均有明显的抑菌效果，抑制效果最好的为10%多抗霉素。本试验结果为进一步进行该病害的防治研究提供了一定的理论依据。
参考文献：
[1] 明·缪希雍.神农本草经疏[M].北京：中国医药科技出版社，2011.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2006.
[3] 陶挺燕，何 凡，范鸿雁，等.几种杀菌剂对荔枝霜疫霉病的室内毒力测定[J].农药，2010，49（1）：72-73.
[4] 张中义，冷怀琼，张志铭，等.植物病原真菌学[M].成都：四川科学技术出版社，1988.
[5] 陆家云.植物病原真菌学[M].北京：中国农业出版社，2001.
[6] 朱桂宁，蔡健和，胡春锦，等.广西山药炭疽病病原菌的鉴定与ITS序列分析[J].植物病理学报，2007，37（6）：572-577.