甘草SRAP—PCR正交试验设计优化及引物筛选
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材料和方法
1.1 试验材料
以本研究小组选育出来的甘草（[WTBX]Glycyrrhiza uralensis Fisch.）优系JA-1（甘草酸质量分数为3.2%）为试材，SRAP引物序列（见表1）由北京赛百盛生物公司合成，dNTP和Taq酶等购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 试验方法
1）DNA提取与电泳检测
CTAB法[8]提取甘草株系JA-1叶片基因组DNA，经1.2%（质量分数，下同）琼脂糖凝胶电泳检测，无菌水稀释至质量浓度为40 ng/μL，-20 ℃冰箱保存。
2）SRAP-PCR正交试验设计
采用引物组合M5-E5（表1）对影响SRAP-PCR反应的dNTP，Mg2+，引物，Taq酶进行四因素四水平的正交L16（44）试验设计（表2）。在20 μL的PCR反应体系中，含有1×PCR 缓冲液和40 ng模板DNA，其他成分含量按表2进行，共16个处理，3次重复。
PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，35 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，5次循环；94 ℃变性40 s，50 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30次循环；72 ℃延伸8 min。1.2%琼脂糖凝胶（添加0.5 μg/mL EB）电泳扩增产物后，采用凝胶成像分析仪拍照。基于条带清晰和带型丰富程度，电泳图谱中最佳组合记为16分，其次记15分，依次类推，最差的记1分，统计结果采用软件SPSS V13.0分析。
3）退火温度优化
基于正交试验设计筛选出的最佳组合，采用单因子试验对退火温度进行优化。退火温度5个水平依次为46，48，50，52，54 ℃。
4）SRAP引物筛选
基于试验结果得出的SRAP-PCR最佳反应体系和反应程序，采用81对SRAP引物组合（见表1）进行稳定性验证和引物筛选。
2 结果与分析
2.1 SRAP-PCR正交试验设计结果直观分析
由于Taq酶、引物、dNTP和Mg2+的浓度不同，SRAP-PCR扩增的谱带条数和清晰度也不同[8]，正如图1所示的正交试验设计的SRAP-PCR电泳结果。正交试验设计L16（44）的统计结果见表2，极差分析表明4个因素对SRAP-PCR反应的影响大小依次为dNTP浓度、Taq聚合酶量、Mg2+ 浓度、引物浓度，方差分析（见表3）表明4个因素彼此之间的差异均表现出显著性水平（P<0.05）。因此，需要对4个因素的不同水平进行分析，其SRAP-PCR结果数值见图2。
2.2 dNTP浓度对SRAP-PCR结果数值的影响
dNTP是PCR反应的原料[9]。本试验中，dNTP浓度对SRAP-PCR结果的影响显示出极显著性水平P<0.01（见表3）。由图2可知，SRAP-PCR结果数值随着dNTP浓度0.10 mmol/L增至0.40 mmol/L时先增大后减小，且在0.30 mmol/L时结果数值最大，此时表现出带型清晰，主带明显（见图1）。应东山等[10]认为dNTP浓度过高时会结合Mg2+，使得反应体系中游离的Mg2+浓度降低。故dNTP最适浓度为0.30 mmol/L。
2.3 Taq酶对SRAP-PCR结果数值的影响
表3表明，Taq酶对SRAP-PCR扩增结果的影响表现出差异极显著（P<0.01）。如图2所示，SRAP-PCR结果数值随着Taq酶用量的增加先增大后减小，且为1.5 U时结果数值最大。图1中，Taq酶1.5 U时谱带清晰、明亮、无杂带。因此。20 μL体系中Taq酶为1.5 U时较好。
2.4 Mg2+浓度对SRAP-PCR结果数值的影响
在PCR反应体系中，Mg2+是Taq酶的激活剂[10]。图2表明，Mg2+浓度为1.5 ～3.0 mmol/L时，SRAP-PCR扩增的结果数值先增大后减小，且在2.5 mmol/L时最大。其原因是Mg2+浓度过低时降低了Taq酶活性，减少了PCR产物量，过高时引起非特异性扩增[10]。故本试验最佳的Mg2+浓度为2.5 mmol/L。
2.5 引物浓度对SRAP-PCR结果数值的影响
引物浓度对SRAP-PCR结果数值的影响见图2，当引物浓度为0.2 ～0.8 μmol/L时，SRAP-PCR的结果数值变化不大，其中引物浓度为0.6 μmol/L时结果数值最大。图1也表明，引物浓度较低时扩增的谱带（非主带）较弱，浓度过高时谱带信号强，但同时背景加深。其原因是引物浓度过低时影响扩增效率，过高时引起与DNA模板链错配产生假阳性条带[11]。因此，引物浓度可选用0.6 μmol/L。
2.6 退火溫度对SRAP-PCR结果的影响
在PCR反应体系中，退火温度影响引物与DNA模板链的特异性结合[11]。由图3可知，退火温度过高或过低时扩增效果都不理想，当退火温度为50 ℃时，扩增出的谱带清晰、明亮，带型丰富。因此，适宜的退火温度为50 ℃。
2.7 SRAP-PCR优化体系的验证与引物筛选
采用优化后的反应体系和反应程序，对81个SRAP引物组合（表1）进行PCR扩增，结果见图4，22对引物表现出了条带清晰、丰富，表明优化后的PCR体系适用于甘草的SRAP分析。筛选出的甘草SRAP引物组合22对（图4）依次为M1-E9，M2-E2，M2-E4，M3-E4，M3-Em8，Me4-E2，M4-E7，M4-E8，M5-E5，M5-E9，M6-E3，M6-E4，M6-E6，M7-E2，M7-E4，M7-E7，M8-E1，M8-E4，M8-E7，M9-E1，M9-E4，M9-E5。
3 结 论
SRAP-PCR的扩增结果受到反应体系、扩增程序以及物种特性的影响[10-12]。因此，要获得条带清晰、稳定的电泳图谱，需要针对试验材料调整和优化反应体系中的不同组分和PCR程序等主要影响因子。
正交试验设计是基于统计学原理，从复因子试验中选出有代表性的水平组合进行试验，这样既减少了处理组合数，又统筹到各因素不同水平间的交互作用，相对于单因素试验和完全组合设计更加高效[7，13]。另外，在正交试验设计中，采用统计分析法可有效地考察出各组分不同水平下的差异显著性，以致试验结果分析得更加科学和完善[14]。当然，在该方法的直观分析中，对试验结果的赋值打分带有一定的主观成分，以致影响到最终各因素最佳水平确定的可靠性[15]。在具体试验中，如本研究中通过增加正交试验的重复次数和验证试验来减少直观因素带来的负面影响。
本研究基于正交试验设计优化了甘草SRAP-PCR反应体系，即在20 μL的反应液中，含dNTP 0.3 mmol/L，Taq酶1.5 U，Mg2+ 2.5 mmol/L，引物0.6 μmol/L，模板DNA 40 ng，1×PCR 缓冲液。通过单因素试验确定了最佳的退火温度为50 ℃。验证试验和引物筛选结果表明，该优化体系稳定、可靠，可以用于甘草的遗传分析和资源评价等研究中。
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