DNA分子标记技术在竹亚科植物遗传多样性研究中的应用
摘要 近年来，分子标记技术已经在竹亚科植物种质资源鉴定、遗传图谱构建、基因定位以及良种选育中得到较为广泛的运用。介绍了常用的分子标记技术及其在竹亚科植物遗传多样性研究中的应用，指出今后应加强分子标记技术在竹亚科植物遗传图谱构建、遗传多样性分析、种质资源的鉴定、辅助选择育种等方面的研究。
关键词 竹亚科植物；分子标记；遗传多样性
中图分类号 S188+.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0141-03
Abstract In recent years， molecular marker technology has been widely applied to Bambsoideae for identification of germplasm resources， construction of genetic maps， gene mapping and breeding of various crops . The several of molecular markers and application in the study of genetic diversity of Bambsoideae had been discussed in the present article. It has been suggested that the application of molecular markers should be strengthened for the construction of genetic maps， genetic analysis， identification of germplasm and marker assistedselection.
Key words Bambsoideae；Molecular marker；Genetic diversity
地球上的竹类植物共有88属1 400多种，主要分布在亚太区、美洲区和非洲区三大块[1]。我国竹类主要分布于长江中下游，其中以福建、浙江、江西、湖南4省最多，占全国竹林面积的60.7%。竹亚科植物具有繁殖生长快、根系发达、适应性广等特点。近些年，我国关于竹亚科植物在分子生物方面的研究逐渐增多。
遗传标记作为基因型易于识别的表现形式，在植物种质资源的开发与利用上具有重要作用。目前应用较为广泛的遗传标记主要有形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记等。随着现代植物分子生物学的快速发展，DNA分子标记技术被广泛应用于遗传多样性的研究，其特点在于可以在各个发育时期的个体、各个组织器官进行检测，不受环境与基因表达与否的限制，信息量大，遗传稳定，多态性高，分子标记可以散布整个基因组。目前，在竹亚科植物中已报道的DNA分子标记主要有ISSR、RAPD、AFLP、SSR共4种，拟对其应用研究进展进行总结，为竹亚科植物的良种选育提供参考。
1 遗传多样性研究的意义
从本质上讲，遗传多样性就是生物体遗传物质的变异，是生物进化的源泉，是物种适应自然环境的基础。一个居群或物种所蕴含着所有生命过程信息，遗传多样性信息越丰富，其对外界周围环境的适应能力越强，越容易拓展生存分布范围。任何遗传多样性的丢失，都会导致该物种对环境变化适应能力的降低以及抵抗疾病能力的降低，同时也使人类丧失了具有潜在应用价值的生物信息和资源[2]。大量研究证明，生物居群中遗传变异大小与进化速率成正比，因此对物种进行遗传多样性研究可为进一步分析物种或群居生物演变进化的历史、方式、适应潜力，以及未来命运提供重要信息，有助于对物种稀有或濒危原因及过程的探索[3]；同时也有助于物种间或种群间亲缘关系的确定，为动植物的分类、进化研究提供重要资料，为系统发育、分类系统的建立提供理论依据，为植物优良育种奠定基础[4]。再者，通过遗传多样性研究，确定物种种内遗传变异大小、时空及其与分布环境条件的关系，有助于制定更加有效的物种保护策略，保护遗传多样性位点和延迟濒危物种灭绝的进度[5-6]。
综上，遗传多样性的研究对物种起源和进化历史的探索，动植物的分类、遗传改良，动植物种质资源的保护具有重要理论与现实意义。
2 遗传多样性的研究方法
遗传多样性是生物多样性最重要也是最基础的一部分，是生物进化与分类的重要依据[7]。随着生物实验技术的发展和生物研究水平的提高，遗传多样性的检测方法日益多样化，可以从不同的角度和层次来揭示物种变异情况。遗传多样性的标记方法可以从以下4个水平进行分析与研究：形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记，以下对分子标记做主要介绍。
分子标记（Molecular marker）是指以生物体内遗传物质DNA的多态性为基础的遗传标记。自20世纪80年代中期以来，分子标记技术的飞速发展使人们对遗传多样性的研究上升到DNA水平，DNA是遗传物质的载体。物种的遗传信息可以反映在DNA碱基的序列结构上，因此生物物种的遗传多样性研究就是基于DNA碱基序列的观察与分析。与形态标记、细胞学标记、生化标记相比，分子标记具有以下几个优越性：①直接以DNA的形式存在，在生物的各个组织、各个发展阶段均可检测到，不受季节、环境和生物体自身因素的影响，不存在表达与否的问题；②分子标记的数量是无限的，遍布整个基因组，用很少量的叶片或种子就可以完成整个分子标记过程；③多态性高，自然界存在着许多等位基因变异，不需要人为创造特殊的遗传材料；④表现为中性，既不影响目标性状的表达，也与不良基因没有必然的连锁关系。基于以上优点，分子标记被广泛应用于植物分子遗传图谱的构建、遗传多样性的分析和种质资源的鉴定、基因定位、关联遗传学等方面[8]。目前分子标记主要分为3类：第1类是以杂交为基础的分子标记，其主要是RFLP（Restriction fragment length polymorphism）限制性片段长度多态性；第2类是以PCR为基础的分子标记，主要包括RAPD（Random amplification polymorphic DNA）随机扩增多态性、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）扩增片段长度多态性、SSR（Simple sequence repeat）简单重复序列和ISSR（Inter simper sequence repeat）內部简单重复序列；第3类是指以单个核苷酸变异为核心的分子标记，其主要是SNP（Single nucleotide polymorphisms）单核苷酸多态性[9]。以下就几种常用分子标记进行介绍。
2.1 限制性片段长度多态性标记（RFLP） RFLP是较早应用于基因标记的分子标记技术，由Bostein于1980年提出。其原理是利用限制性内切酶切割样品基因组DNA，酶切后会产生许多大小、长度不一的限制性DNA片段，通过电泳再利用杂交技术和DNA探针相结合，这样产生的杂交带便能在放射性自显影中显示出来，从而检测到不同遗传位点的等位变异情况，呈现不用材料DNA限制性片段多态性图谱。RFLP标记可以提供大量的标记，且不受外部环境、组织特异性的干扰，具有结果稳定可靠、重复性好、共显性等优点，但其需要大量的样品DNA且要求材料组织足够新鲜[10]。
2.2 随机扩增多态性标记（RAPD）
RAPD是由Williams和Welsh于1990年分别研究提出的运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记[11-12]。其原理是以基因组DNA为模板，利用一个随机寡核苷酸序列（一般为10个碱基）为引物，通过PCR扩增反应，产生的片段DNA产物经电泳检测分离后，再用放射性自显影技术或EB染色法检测该研究对象的多态性谱带。RAPD标记所需DNA用量少、操作简单、检测方便、敏感性高；引物是随机合成，不需要参照物种的基因组序列就可以设计引物，一个引物可以扩增出许多片段，几乎覆盖整个基因组。但用于RAPD标记的引物都很短，导致退火温度低，容易引起引物和模板DNA的错配现象，因此实验重复性差[13]。
2.3 扩增片段长度多态性标记（AFLP）
AFLP是由Zabeau和Vos于1993年创建的基于RELP和RAPD的，可以选择性地扩增限制性片段的分子标记技术。其原理是利用限制性内切酶切割基因组DNA，形成酶切DNA片段后，再将双链人工接头连接在DNA片段两端，作为扩增反应模板，以接头序列和相连的酶切片段碱基序列作为引物结合位点，然后选择性地扩增某些酶切片段，扩增片段经聚丙烯酞胺凝胶电泳分离、检测。AFLP标记的引物是人工合成的且具有通用性，不需要知道DNA序列信息；多态性非常高，不同的限制性内切酶组合在理论上可以有无限多个多态性位点；扩增片段短，因此分辨率高。但AFLP标记操作过程复杂，费用昂贵且对基因组DNA和限制内切酶的质量要求较高[14]。
2.4 简单重复序列标记（SSR）
SSR是由Moore和Sollotterer等于1991年提出的广泛分布在真核生物中，由1～6个核苷酸为单位组成的短的、串联的单拷贝序列，又称为微卫星[15]。其原理是根据微卫星两端的序列设计一对特异的引物，通过PCR扩增出核心微卫星DNA序列，再利用电泳分离、检测每个SSR位点上的多态性[16]。SSR位点遍布整个基因组DNA，提供丰富信息，该技术可检测较高的多态性；SSR侧翼序列保守，有助于提高引物设计效率[17]。SSR标记表现为复位共显性标记且该方法测定速度快、重复性好[18]，但SSR技术的引物设计需要预知基因的序列，使得研究费用和条件较高。
2.5 内部简单重复序列（ISSR）
ISSR分子标记是在SSR序列的基础上，加上1～4个核苷酸作为ISSR-PCR反应的引物，从而使DNA序列放大，表现出较高的重复性和稳定性[19]。SSR序列在高等生物的染色体内广泛存在，所以利用ISSR技术可以得到较多的分子标记，呈现出较高的多态性[20]。ISSR分子标记技术兼有SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，因其稳定性好、重现性好、多态性好、产物特异性强等特点[21]，现已被广泛应用于植物的种质收集、品种鉴定、遗传作图、基因定位、标记辅助选择等诸多领域[22]。
2.6 单核苷酸多态性标记（SNP）
SNP最早在1994年人类分子遗传学杂志上出现，1996年Lander第一次正式提出SNP是继RFLP、SSR之后的又一种新型分子标记[23]。SNP是指生物基因组DNA中个别单核苷酸变异引起的多态性，这些变异包括碱基的转换和颠换或只有小的插入和缺失，大约2/3的SNP标记是由单个同类碱基的转换引起的[24]。SNP具有分布最广泛、标记数目多且稳定性高、二态性等特点。
3 DNA分子标记在竹亚科植物中的应用
3.1 遗传多样性分析
研究竹亚科植物的遗传多样性对竹亚科各属植物保护、良种选育、种质资源的遗传改良具有重要意义。Desai等[25]应用RAPD和ISSR方法对生长于印度13个基因型竹种进行遗传多样性研究，30条RAPD引物共扩增出645个条带，其中多态性条带623个，平均每个引物扩增20.76个条带；12条ISSR引物共扩增出246个条带，其中多态性条带241个，平均每个引物扩增20.08个条带。该数据表明不同基因型竹种间存在着丰富的遗传多态性。Yang等[26]运用ISSR技术对黄竹（Dendrocalamus membranaceus Muo）云南自然分布区内的12个种群进行遗传多样性分析，10条ISSR引物共扩增出155个条带，其中153个为多态性条带（98.71%），表明黄竹种群间存在丰富的遗传多样性（0.349）和较低水平的遗传分化（0.252）。
3.2 指纹图谱构建
由于DNA分子标记可以覆盖整个基因组，能客观地反映各竹种以及竹种各种群DNA水平的差异，因此竹亚科各属植物指纹图谱的建立，有助于各种质资源之间的相互鉴定。Qu等[27]利用18个引物分析30个竹亚科各属竹种的遗传多样性，并针对每一个竹种建立唯一的指纹图谱库，为竹亚科各竹种分類奠定基础。吴益民等[28]借助RAPD技术分析孝顺竹（Bambusa multiplex）、凤尾竹[Bambusa multiplex var.nana（Roxb.）Keng f.]、绿竹（Dendrocalamopsis oldhami）、白绿竹（Bambusa multiplex）4个品种的遗传多样性，首次构建反映种特征的RAPD指纹图谱，为4个竹种鉴定提供分子水平的科学依据。
3.3 亲缘关系鉴定及分类
根据遗传距离或遗传相似系数进行聚类分析，并建立聚类树状图，区分竹种或各种群，研究聚类结果有无明显地域特征。Tian等[29]利用ISSR技术分析了龙竹（Dendrocalamus giganteus Muo）7个种群间的亲缘关系，并且按照亲缘关系将7个种群分成2组。Baishya等[30]利用RAPD技术对印度东北地区30个竹种进行亲缘关系鉴定，并采用UPGMA聚类法将竹种分成3组。Friar等[31]应用RFLP技术对26种竹子的42个不同基因型进行DNA多态性研究，根据品种间亲缘关系远近，鉴定出其中25种为散生竹。
4 结语
竹亚科植物广泛生长于我国南方省市。丛生竹林在生物固碳领域有着巨大作用，同等面积下的竹林较树林可多释放出35%的氧气，具有很好的生态效益。竹亚科植物具有繁殖生长快、根系发达、蓄水保土、适应性广等特性，在沿海沙地引种，与木麻黄、马尾松进行混交种植形成沿海防护林，可以起到防风固沙效果。由于我国南部沿海常年受台风、风暴潮等自然灾害影响，因此加强沿海防护林系统建设避免更大的经济和生命损害十分有必要。首先要做的就是保护它们的遗传多样性，选择遗传多样性水平更高的竹亚科植物是关键。
DNA分子标记技术，为竹亚科品种和种源的鉴定提供了更为准确、可靠、方便的方法，与形态标记、生化标记相比，DNA分子标记技术具有独到之处：竹亚科植物的任何组织在任一发育时期均可用于分析；每一位点总存在多态性，遗传稳定，既能探索品种间染色体组孟德尔遗传因子方面的差异，又能揭示母体细胞质方面的非孟德尔遗传因子的影响；分子标记的数量是无限的，遍布整个基因组，用很少量的叶片或种子就可以完成整个分子标记过程；DNA分子标记不受任何环境因素、生物体自身因素的影响，因为环境只影响基因表达转录与翻译，而不改变基因结构；分离出的样品DNA在适宜条件下可长期保存。基于以上优点，分子标记可被广泛应用于植物分子遗传图谱的构建、遗传多样性的分析、种质资源的鉴定、基因定位、关联遗传学等方面。
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