白楠大小孢子发生与雌雄配子体的发育观察
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+vޝj{ajgjh "ݚ'+h "fy}隕h z^hgبi^&Mzɵ v^ff~fYi]5馝"https://www.jianbiaow.cn/t/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料。也是用来制作紧密仪器和造船材料的不二选择[3]。且树形优美，枝繁叶茂，生长非常迅速，是极佳的庭荫树种和绿化树种。同时白楠也是亚热带常绿阔叶林中及其重要的伴生树种，有着非常强大的生态调节功能。所以发掘和使用白楠这一珍贵树种资源具有重要意义[4]。
湖北林业科技第46卷第6期邓金胜，等：白楠大小孢子发生与雌雄配子体的发育观察楠木向来有“木中金子”之称，其材质通直圆满、纹理美观、结构细致、质韧难朽、奇香不衰，用途十分广泛，为江南四大名木之冠。由于楠木巨大的经济价值和广泛的用途，导致其野生资源被破坏得极其严重，目前已难觅天然楠木林，许多楠属植物沦为濒危或渐危树种[5]。根据《中国植物红皮书—稀有濒危植物名录》（第一册）和1999年国务院批准发布的《国家重点保护野生植物名录》（第一批），楠属的楠木（Phoebezhennan）、闽楠（P.boumei）、浙江楠（P.chekiangensis）、滇楠（P.nanmu）等均为濒危种，为国家Ⅱ级保护植物[6-7]。要保护楠木资源，首要任务是要为其提供较强的繁殖能力。从繁殖的角度来看，种子植物有性生殖过程大致可分为4个阶段：雌雄配子的发育、传粉与受精、胚发育和
果实（种子）成熟、成熟种子散步与萌发[8]。
而目前对于楠木各个树种的研究报道很少，无法对其生殖生育的整个过程形成一个系统的认识，对于白楠的研究几乎没有。本研究在前人的研究基础上，对白楠花发育过程中，大、小孢子发生及雌、雄配子体的形成进行了详细的细胞学观察和研究，旨在为该种资源保护、良种繁殖和系统进化研究提供生殖生物学方面的基础资料。
1材料与方法
1.1实验材料
本研究采用的实验材料来自长江大学盆景园内的白楠树。从它的花期开始，每隔3d采集一次，采集不同时期的白楠花，取材料时用高枝剪剪下。采集材料之后用70%FAA溶液进行固定。70%FAA溶液由5mL甲醛、冰5mL乙酸和90mL70%乙醇组成。
1.2实验方法
1.2.1常规石蜡切片法的制片过程
（1）材料固定：将小花投入装有FAA固定液（20倍材料）中的青霉素小瓶，用真空抽气泵缓慢抽去花芽中的气泡，等到花芽沉入瓶底后，停止抽气，更换FAA固定液。放入4℃冰箱，固定4h以上。
（2）脱水：抽气完成后，将花芽从FAA中取出，依次通过50%、70%、85%、95%、100%浓度的酒精浸泡润洗，每个浓度浸泡2h。
（3）透明：花芽从100%乙醇取出后依次经1/2二甲苯+1/2无水乙醇、二甲苯透明，每一级2h。
（4）浸蜡：脱水时间足够后，将杯中的二甲苯倒掉一部分，留约1/3左右的二甲苯置于杯中，然后塞入软蜡蜡屑，放入温度为38℃的烘箱中过夜，第二天将软蜡倒掉，倒入纯蜡蜡液，将烘箱温度调整为62℃，4h换一次纯蜡，共换3次。
（5）包埋：将融化的纯蜡和材料的混合物一起倒入纸盒中，用加热的镊子将其铺开排列整齐，然后将其浸入冷水中使其冷却凝固。
（6）切片：找到材料的纵切和横切方向，将其粘在蜡台上。将粘好蜡块的蜡台固定在切片机上，并使蜡块的水平方向与刀片平行，进行连续切片，切片厚度8～10μm。
（7）粘片：取干净的载玻片，在上面涂上适量的明胶，滴加少量蒸馏水，从蜡带上切下1小段粘在载玻片上，在42℃展台上展片，切片烘干展平后取下放入切片盒中，放置2d以上方可染色。
（8）染色封片：采用番红-固绿对染，石蜡切片→二甲苯脱蜡（5min）→1/2二甲苯+1/2无水乙醇（2min）→100%乙醇（2min）→95%乙醇（2min）→85%乙醇（2min）→70%乙醇（2min）→50%乙醇（2min）→蒸馏水（2min）→1%番红染液（2h）→蒸馏水（1min）→50%乙醇（1min）→70%乙醇（1min）→85%乙醇（1min）→95%乙醇（1min）→0.1%或0.5%固绿染液（40s）→95%酸酒精（1min）→100%乙醇（2min）→1/2二甲苯+1/2无水乙醇（2min）→二甲苯透明（5min）→树胶封片，贴好标签。其中樹胶的配方为明胶2g、石炭酸4g、甘油30mL、蒸馏水200mL。
1.3观察与照相
在光学显微镜下观察做好的切片，并用数码相机进行拍照。
2结果与分析
2.1白楠花的形态结构分析
白楠花的整体结构，自外向内由外层苞片、内层苞片、雄蕊、雌蕊组成，白楠花中存在着很多粘液细胞和油细胞（图1a）。白楠有雄蕊9枚，外轮6枚，内轮3枚，并且存在着腺体（图1b）。一个成熟的花药是由花粉囊和药隔两部分组成，白楠的花药有四室，花药由表皮、药室内壁、中层和绒毡层组成，在药室内壁上可以观察到明显的粘液细胞（图1c）。
关于白楠雌蕊的形态结构，观察发现在白楠中存在着少数双胚现象，由图1d可以看到胚囊中有两个正在发育的胚珠。白楠的胚珠为倒生胚珠（图1e），形成倒生胚珠的原因为分裂后两侧生长的速度不一致而导致。白楠柱头的形状为两头窄，中间较宽，在柱头旁边还存在着腺体（图1f）。
a.花的纵切b.花的横切c.花药四室d.白楠的双胚珠现象e.倒生胚珠f.雌蕊的纵切
2.2小孢子发生和雄配子体发育
一个完整的花粉囊，由表皮、中层、绒毡层和花粉粒组成，在花粉囊形成的同时，初生造孢细胞也开始分裂形成花粉母细胞（图2a）。初生造孢细胞核大，质浓，分裂能力很强。在发育的初期，花粉母细胞为不规则的多边形，排列比较紧密，周围的绒毡层很明显，经过慢慢的发育，花粉母细胞逐渐发育成近圆形，细胞间的距离变大，不再排列得很紧密（图2b）。在小孢子发育过程中，由于绒毡层不能及时降解，从而出现了败育现象，导致小孢子发育异常，细胞空瘪（图2c）。当花粉母细胞发育到一定的时期后，会开始减数分裂，形成四分体。在四分体时期，每个小孢子共用胼胝质壁。当胼胝质壁溶解后，单核花粉粒从四分体中分离出来，但要形成成熟的花粉粒还需要继续发育。花粉粒初期细胞壁很薄，质浓，核位于细胞中央，但经过一段时间的发育之后，它们不断的吸收绒毡层或其他降解物之后，体积增大，小液泡形成中央大液泡，细胞核此时会被挤向一边，此为单核花粉的单核靠边期（图2d）。形成单核花粉粒之后，吸收绒毡层或其他降解物，细胞核再进行一次分裂，此时可见明显的花粉壁，形成二细胞型花粉粒（图2e），一个为营养核，另一个为生殖核，发育为一个成熟的花粉粒。
a.花粉母细胞初期b.花粉母细胞发育中期c.败育小孢子d.单核小孢子e.二细胞小孢子
a.大孢子母细胞时期b.大孢子四分体c.单核胚囊d.二核胚囊e.四核胚囊f.八核胚囊
2.3大孢子发生与雌配子体发育
白楠为子房一室，单胚珠，倒生，蓼型胚囊发育。发育过程中，造孢细胞分化为大孢子母细胞（图3a），造孢细胞体积大，质浓，液泡不明显。随后大孢子母细胞经过分裂形成四分体，此为大孢子母细
胞四分体时期（图3b）。在大孢子四分体时期，仅有一个发育成功能大孢子，其余三个逐渐退化，而功能大孢子发育成为单核胚囊。单核胚囊（如图3c）经过三次有丝分裂，分别形成二核胚囊（图3d），四核胚囊（图3e）和八核胚囊（图3f）。
经过第一次减数分裂之后，两个细胞核会在发育过程中逐渐向两端移动，形成二核胚囊。二核胚囊通过进行两次分裂，形成四核、八核胚囊，在胚囊细胞的发育过程中，每端的四个细胞核中，会有一个向胚囊中部移动，这两个细胞称为极核，极核与周围的细胞质一起形成胚囊中最大细胞，中央细胞。
靠近合点端的三个细胞为反足细胞，靠近珠孔端的为一个卵细胞和两个助细胞。发育成熟的胚囊为八核七细胞型，一个卵细胞，两个助细胞，三个反足细胞，两个极核。
3讨论
白楠为樟科楠属，本次对其胚胎学的研究发现其与樟科的胚胎学特征基本相符合。胚珠倒生，双珠被，厚珠心，大孢子四分体为直线型，胚囊发育为蓼型，与樟科基本特征一致[9-12]。
在Kweon等[9-10]对樟科的报道中指出樟科花药室存在2室和4室，在传统形态分类学中，花药室的数量是对植物进行分类的一个重要依据。根据实验中发现的白楠花药室的数量来看，白楠的花药室为4室，是很典型的樟科植物的特征。植物的绒毡层类型分为腺质绒毡层和变形绒毡层两种，根据对实验中大量切片的观察结果来判断，白楠应属于变形绒毡层，当小孢子四分体解体后，绒毡层会分解，形成原生质团将小孢子包围。
本次研究在白楠中发现了多胚现象，多胚现象是指在被子植物的胚珠中包含两个或两个以上胚的现象。在白楠中发现的为双胚珠现象，目前有研究表明，多胚现象的出现与无融合生殖有着正相关性。所以通过对其胚胎学特征的研究，对该物种在育种上有着重大的意义[13-15]。
在大量的切片中，可以看到在小孢子在成熟的过程中，会出现部分花粉败育现象，小孢子发育异常，细胞空瘪，从而导致雄性不育。而导致小孢子败育的主要原因可能为绒氈层不能及时降解，迟缓消失，在小孢子四分体解体之后，绒毡层不能及时的分解进入花粉囊中，从而导致小孢子发育不良，不能正常的进行有丝分裂，出现空瘪等现象。在目前已知的报道中，绒毡层发育异常是导致败育的普遍因素之一，在高粱不育系[16]的研究中，出现了绒毡层细胞过度发育和液泡化的异常现象，此外在萝卜[17]、水稻[18]、玉米[19]等雄性不育的研究中也出现了绒毡层无法及时降解的异常现象。
由此可以看出，绒毡层迟缓消失很可能是导致白楠小孢子出现败育的主要原因之一，从而导致白楠繁殖能力低下。所以我们可以通过其他办法找到绒毡层异常、无法及时降解的原因，从而提高白楠的繁殖能力。
通过实验，发现白楠花革质化比较严重，且还有很多油细胞和粘液细胞[20]，这对开展实验造成了一定的困难。由于革质化比较严重，导致采用石蜡切片法进行操作时，会出现蜡无法完全进入和切片时的破碎。而油细胞和粘液细胞的存在，会导致抽气不完全，对实验的进行产生一定影响，故认为常规石蜡切片法可能对白楠的胚胎学研究不是最适合的，建议以后采取别的实验方法，如冰冻切片法等。
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