西瓜细胞工程技术研究进展
摘 要：西瓜是世界重要的经济作物之一，利用细胞工程技术可解决西瓜生产中的突出问题。本文系统总结了国内外关于西瓜细胞工程技术的研究进展，并对今后的研究方向进行了展望，以期为西瓜细胞工程技术研究、品种改良和种质创新提供参考。
关键词：西瓜；细胞工程；细胞遗传学
中图分类号：S651 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2017）14-0038-05
西瓜[Citrullus lanatus （Thunb.） Mansfeld，2n=2x=22]属于葫芦科西瓜属，是世界重要的经济作物之一，也是我国种植面积最大的主要瓜类作物，生产优质高产西瓜是农民增产增收的重要渠道。西瓜的品质和产量受到遗传基础狭窄和病虫害等因素的影响，因此利用细胞工程技术培育优质高产、具有综合抗性的西瓜新品种具有重要意义。本文系统总结了国内外关于西瓜细胞工程技术的研究进展，并对今后的研究方向进行了展望，以期为西瓜细胞工程技术研究、品种改良和种质创新提供参考。
1 细胞遗传学基础
1.1 染色体核型分析
染色体核型分析是细胞遗传学的基础，可应用于西瓜遗传分析、进化与品种间亲缘关系研究，同时也为西瓜亲本选配和新品种遗传育种研究提供重要依据。一般依据染色体长度、臂比、缢痕、随体和核型不对称系数等进行[1]。
西瓜的染色体小，形态上不易识别，有丝分裂中期形态分化太少且细胞分裂时核膜消失较晚，染色体粘连等因素，导致染色体不易分散[2]，故一般选择形态端正、分散良好的前中期染色体分裂相进行核型分析。研究发现，西瓜根尖细胞分裂相受胚根长短的影响，以胚根长为1.0～1.5 cm的根尖细胞中期分裂相最多，铁明矾-苏木精染色观察效果最
佳[3]。
目前关于西瓜染色体各种参数的报道不一致，Trivedi等[4]认为，西瓜中期染色体长度变化在1.24～2.88 μm，绝大部分为亚中着丝点（sm）染色体，无次缢痕，据郭德栋等[5]报道，Щелеина 等发现染色体长度变化在1.5～4.0 μm，有1对随体（SAT）染色体，而Φypca研究发现染色体长度变化在1.8～2.7 μm，大都为中部着丝点（m）染色体，只有1对染色体不等臂。吴国江[2]建立了标准西瓜粗线期染色体核型，认为西瓜粗线期染色体的染色粒呈近中分布类型，异染色区定位于着丝点附近，并对金夏西瓜品种进行核型分析，发现其为2n=2x=22=20 m+2 sm核型，染色体长度变化在1.98～3.31 μm，除第2对染色体为次中部着丝点染色体外，均为中部着丝点染色体。赵虎基等[6]通过对12个西瓜品种染色体核型分析发现，着丝点区和随体未发生变异，籽用西瓜品种和饲用西瓜均為1A类型（2n=2x=22=20 m+2 sm或
22 m），与李琦等[7]的报道是一致的，而久比利、三单四和红优二号3个西瓜品种属2A类型（2n=2x=22=20 m+2 sm或18 m+4 sm）且1A类型比2A类型对称性高，说明2A类型比1A类型进化程度高。此外，张志忠等[8]采用玻璃针法，成功分离得到西瓜第一单染色体并进行扩增，建立了西瓜第一单染色体DNA文库，为西瓜的基因定位和克隆奠定基础。
1.2 染色体原位杂交
分子细胞遗传学随着染色体研究技术的创新而得到快速发展，出现了荧光原位杂交（FISH）技术、基因组原位杂交（GISH）技术，为更精准分辨染色体提供了一条途径。FISH特点是敏感快捷，能同时显示多种颜色等，因此能同时进行多个探针的定位以及次序确定，可应用于准确鉴定植物染色体，染色体识别、易位系鉴定、构建物理图谱、基因组进化研究、转基因的细胞学鉴定、外源染色质检测等。李琦等[7]应用FISH技术成功将45S rDNA 和5S rDNA 定位在西瓜中期染色体上，杂交结果显示西瓜
45S rDNA 杂交信号有2 对，较强的1对位于2号染色体短臂末端，较弱的1对位于4 号染色体短臂中部；5S rDNA 杂交信号有1对，位于7号染色体短臂近着丝粒处。赵泓等[9]以rDNA为探针，利用FISH技术通过对22份西瓜染色体定位分析发现，三大生态类型（东亚类型、美洲类型和egusi类型）的17份西瓜栽培变种含有1对5S rDNA位点和2对45S rDNA位点。其中2对45S rDNA位点分别位于2对染色体长臂非常接近末端的地方，信号亮度无明显差异；5S rDNA位点位于其中1对45S rDNA位点内侧。4份栽培种中的野生变种含有5S rDNA位点和45S rDNA位点各2对，它们分别位于4对染色体的末端或近末端。而1份野生种具有的2对45S rDNA在信号亮度上无明显差异，但其中1对靠近着丝粒的5S rDNA的拷贝数明显少于另外1对靠近端部的5S rDNA，上述结果强有力地支持了现有的西瓜分类。
GISH可应用于异源多倍体品种染色体结构的分析和植物基因组结构特征分析，能反映重复序列的信号分布特征，分析物种间亲缘关系，其特点是操作简单，更准确直观。常珂玮等[10]通过对缺须西瓜、热迷西瓜、药西瓜和诺丹西瓜有丝分裂中期染色体进行比较基因组原位杂交分析，揭示了西瓜属物种间的亲缘关系，同时对诺丹西瓜（2n=24）的归属问题进行了分析，发现西瓜（2n=22）与诺丹西瓜之间只在随体上存在共享的同源重复序列，而甜瓜（2n=24）与诺丹西瓜之间共享的保守重复序列几乎遍布诺丹西瓜的所有染色体，表明诺丹西瓜和甜瓜之间具有非常近的亲缘关系。
2 组织培养
2.1 外植体培养
通过西瓜外植体培养获得再生植株是离体培养中研究较多、较成熟的技术，在降低种苗成本、确保纯度的同时也为重要性状遗传转化提供基础。基因型、外植体类型、激素的种类和浓度、苗龄等因素影响西瓜再生体系的建立。
在离体培养中，西瓜未成熟子叶不定芽分化频率可达100%，通常认为子叶是比较理想的外植体[11]。研究发现，胚胎在黑暗条件下发芽可以提高子叶的器官再生能力[12]，子叶的末端具有最高的再生频
率[13]，再生不定芽最适培养条件为MS+1～2 mg/L
6-BA[12，14，15]。目前已经建立了完善的子叶[16]、下胚
轴[17]和顶芽[18]等外植体的再生体系，以达到稳定基因型的目的。有报道认为，西瓜不定芽诱导频率由高到低依次为茎尖[19]、带完整子叶的顶芽[20]、子叶的末端[13]、不成熟的子叶[14]、0.5～1.0 cm胚轴[14]、3～
5 mm的果实切片[21]。此外，未受精胚珠和未授粉子房離体培养也有相关报道。研究发现，从授粉后结实14～28 d的西瓜以不成熟种子的子叶为外植体也可得到胚状体，但再生频率很低，因而通过体细胞胚得到再生植株不切实际[11]。而张莉[22]初步建立了西瓜体细胞胚诱导体系，认为在MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L培养基中，诱导率达到54.7%，同时发现2%的蔗糖浓度适合西瓜体细胞胚萌发。闫
静[23]建立了伊选类型和京欣类型西瓜愈伤组织的诱导体系，在MS+IAA 0.1 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培养基中，两类西瓜愈伤组织不定芽分化频率最高。刘丽锋[24]研究发现，铁盐对西瓜组培苗黄化的影响最大，将Fe-EDTA浓度加倍，组培苗生长健壮，能持续继代。此外，西瓜在离体培养过程中易产生玻璃化苗，有报道认为，降低培养湿度可有效减少玻璃化苗的发生[25]。
2.2 花药和小孢子培养
西瓜花药培养受多种因素的影响，包括基因型差异、小孢子的发育阶段、花蕾的预处理方式、供体植株的生理状态、基本培养基成分等因素[26]，其中培养基的组成是影响诱导胚状体形成愈伤组织和植株再生的关键因素。
西瓜花药培养始于20世纪70年代初，通过对琼酥和周至红2个西瓜品种进行花药培养，获得了单倍体植株，但其愈伤组织的诱导率仅为0.5%，不利于育种上利用。薛光荣等[27]通过花药培养获得的花粉植株经过加倍得到了1个高产、抗病的西瓜优良品种。袁万良等[28]通过改良培养基，解决了愈伤组织褐变死亡的问题，将愈伤组织诱导率从0.5%提高到94.4%，并且快速诱导出了绿色愈伤组织，为获得西瓜单倍体植株奠定了基础。魏瑛等[29]通过对西农8号和京欣l号2个西瓜品种花药进行愈伤组织诱导，获得了57.7%～62.9%的诱导率。李娟[30]认为在4℃处理2 d条件下，西瓜花药愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+KT 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L，诱导率为57.84%。西瓜花药培养技术虽有较多优势，但由于花药愈伤组织诱导率低以及分化频率极低等问题的存在，目前仍未能广泛应用于西瓜遗传育种中。
小孢子培养排除了药壁组织二倍体体细胞的干扰，是获得单倍体的重要途径之一，可为快速配制杂交种提供材料，也是分子标记和基因图谱的理想材料。花粉的发育时期是决定花药培养能否形成花粉愈伤组织或花粉植株的至关因素之一。王玉英等[31]认为大多数植物在单核靠边期进行花药培养效果是最佳的。李娟[30]研究发现，西瓜花药培养的最佳时期是单核靠边期到双核期，其机理有待进一步研究，此外不同基因型西瓜在游离小孢子培养过程中对温度的敏感性不同，同时早上采集花蕾其花粉活力较强，高温热激36℃处理4 d的效果较好，在1/2 NLN液体培养基中培养后，小孢子能膨大分裂形成细胞团和愈伤组织。
2.3 原生质体培养
原生质体为遗传操作提供了理想受体，通过该技术可获得体细胞杂交种，目前采用电融合技术成功地进行了西瓜和甜瓜原生质体的融合，通过Southern 分子印记杂交技术，检验出了原生质体异融合愈伤组织，该方法可以克服远缘杂交不育和缩短育种年限[32]，同时也为创造新材料和新种质开辟新途径。李仁敬等[33]通过化学融合，以西瓜子叶原生质体获得愈伤组织，并发现原生质体的分裂频率与基因型有关。王静[34]建立了西瓜叶片原生质体制备的最佳条件，为2.7%纤维素酶+0.78%离析酶R-10溶于0.4 mol/L甘露醇中，转速800 r/min，酶解时间120 min，西瓜叶片原生质体产率最高，制备效果最好。
3 基因转化
抗性育种对于培育生产优质高产西瓜品种具有重要意义，通过转基因技术可以为抗性育种提供支持。西瓜转基因主要以子叶为外植体，遗传转化方法除农杆菌介导法是技术较成熟、机理较明确的途径外，花粉管通道法[35]、基因枪介导法[36]、DNA浸胚法[37]、胚囊子房注射法[38]、PEG法、电激法等也有
应用。
目前已成功将卡那霉素抗性筛选基因（NPTⅡ）和标记基因（GUS）[15]、ACC合成酶基因及其反义基因[39]、西瓜花叶病毒1号的外壳蛋白基因（WMV-1 CP 基因）[40]、西瓜花叶病毒2号的外壳蛋白基因（WMV-2 CP 基因）[41]、西瓜花叶病毒（WMV）外壳蛋白基因、西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）复制酶基因、黄瓜花叶病毒（CMV）复制酶基因[42]、NPR1基因、几丁质酶基因、几丁质酶-葡聚糖酶双价基
因[43]、酵母腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因[44]、酵母HALI基因[45]、八氢番茄红素合成酶基因[46]、GGPS基因、编码CGMMV-CP的cDNA基因等成功转入西瓜基因组中获得转基因再生植株。与西瓜有近缘关系物种的总DNA也有应用，如瓠瓜DNA、黑籽南瓜DNA等。宋道军等[47]利用离子束处理将银杏耐辐射异常球菌基因组DNA成功导入西瓜，该方法实现了超远缘分子杂交，为西瓜遗传育种拓展了新方法。此外，体细胞突变体筛选也可作为西瓜抗性种质创新的重要途径。
4 问题与展望
随着细胞工程技术的发展，细胞遗传学、组织培养及基因转化等在西瓜遗传育种中得到了广泛应用，但以下问题有待于进一步研究。
①西瓜遗传基础狭窄利用离体培养过程中产生体细胞无性系变异的特性，应加强体细胞无性系变异的筛选研究，重视抗性突变体筛选、抗病种质资源匮乏以及抗病性遗传规律复杂等问题。
②获得高频、高质、同步性好的体细胞胚是人工种子生产的关键。通过细胞工程技术生产三倍体无籽西瓜人工种子，可以降低种苗成本。
③西瓜花药培养单倍体的诱导率低，重复性差，有待于进一步提高。
④西瓜细胞工程研究体系的培养效率不高，后代群体不够大，不利于在遗传育种中的应用。
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Abstract： Watermelon is one of the most important cash crop in the worldwide. Research on cell engineering technology is actually an effective way to solve a series of problems in watermelon production. This paper systematically summarized the research achievements of cell engineering technology in watermelon， and also suggested some future directions which could provide valuable references for the research of cell engineering technology， cultivar improvement and germplasm
innovation.
Key words： Watermelon； Cell engineering； Cell genetics