麦洼牦牛PRL基因多态与产奶性状的关联分析
材料与方法
1.1材料
于阿坝州红原县玛莎村、热多村和泽木科3个区域随机抽取活泼健康、体形正常的2～4胎次母牦牛49头，并记录其耳号。于2017年6—10 月清晨牧民挤奶时测定日挤奶量，每10 d测定一次，指标测定和记录均分别由专人进行。挤奶量测定期间同时采用无菌注射器采集麦洼牦牛血样，共取得血样49份，盛装于无菌15 mL离心管中。血样现场暂存于冰盒中，后保存于-60 ℃超低温冰箱中待用。
1.2主要试剂
血液基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit，50preps离心柱型）产自天根生化科技（北京）有限公司;PCR反应体系配制使用的2×Taq PCR Mastermix购自天根生化科技（北京）有限公司;Trizma base， Brotic acid和EDTA等试剂均产自VETEC公司;核酸染料Goldview 购自博奥拓达科技（北京）有限公司。
1.3DNA提取和检测
采用血液基因组DNA提取试剂盒提取麦洼牦牛血样DNA。血样于-60 ℃冰箱中取出后放置于水中解冻，再按照DNA提取试剂盒中提供的说明书步骤进行操作，提取DNA产物放置于-20 ℃冰箱中备用。制备1%琼脂糖凝胶，用移液枪吸取1 μL的6×Loading buffer，与 4 μL DNA产物在PE手套上混匀，再吸取混匀后的液体加入琼脂糖凝胶板上的点样孔内，旁边点上Marker DNA 4 μL， 121 V条件下电泳40 min，再通过照胶仪于紫外光下检测DNA纯度，对有杂带或纯度不高的样品重新提取血液DNA并进行检测。
1.4引物合成和PCR扩增
参考文献[9]中对水牛PRL基因多态性的研究，设计一对引物序列用于样品中PRL基因的扩增，引物序列为F：5’-AAGCCTTTTACATTATTTCAACCC-3’，R：5’-AATTCTCTGACCTCA AGCCACTCT-3’，引物由上海英潍捷基公司合成。PCR扩增产物长度为1 103 bp。
PCR反应体系25 μL：包括DNA模板1 μL，上下游Primer各1 μL，2×Taq PCR Mastermix（含染料）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃终延伸5 min;4 ℃保存。制备1%琼脂糖凝胶，PCR反应结束后取5 μL产物电泳40 min后，于紫外灯下观察其扩增结果。合格PCR产物保存于-20 ℃冰箱中，以待测序。
1.5SNP筛选和序列分析
按照测序要求准备PCR产物及引物，直接寄送英潍捷基贸易有限公司（广州实验室）进行双向测序。测序返回的正反向序列，运用DNAMAN 5.0对扩增序列的测序结果与NCBI上参考目的片段序列进行比对并校正拼接;使用Chromas软件对测序峰图进行分析，筛选获得SNPs位点。
1.6统计分析
运用DNAMAN5.0对序列进行校正和比对分析，测序峰图采用Chromas软件进行分析，利用SPSS 21.0软件比较样本类群间2种基因型和产奶量之间的关联性，并进行显著性检验（P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性 差异）。
2结果与分析
2.1麦洼牦牛基因组DNA提取与检测
采用紫外分光光度计对提取的麦洼牦牛血液基因组DNA进行纯度检测，浓度均在100 ng/μL以上，DNA样品测定的OD 260/OD 280比值均在1.6～1.8，符合要求。经1%的琼脂糖凝胶电泳检测（图1），在紫外灯照射下基因组DNA条带明亮单一，表明所提DNA样品浓度质量好，可以用于展开后续的PCR试验。
2.2牦牛PRL基因PCR扩增产物检测
根据设计引物对麦洼牦牛PRL基因的5’侧翼调控区序列进行扩增，扩增出的麦洼牦牛PRL基因序列长度为1 103 bp，产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯照射下结果均和目的片段大小相一致，条带单一且清晰（图2），可用于测序分析。
2.3牦牛PRL基因SNPs的筛查和检测
扩增产物经胶回收纯化后进行正反双向测序，均由测序公司完成。采用DNAMAN 5.0软件拼接原始序列，并对测序峰图进行分析，共筛查到1个疑似SNP位点，位于目标基因序列的998 bp处，正常序列为5’-ATGAAATG-3’，突变序列为5’-A_GAAATG-3’，该处碱基T缺失。进一步比对全部样本的测序结果，共计29个样本中发现了该位点处T碱基缺失，初步确定为SNP位点。
2.4PRL基因多态性与牦牛泌乳性状的相关性
将所有样本按照突变型（T碱基缺失）和正常型分为2组，对2种基因型下牦牛153 d产奶量、乳脂、乳蛋白、乳糖和体细胞数等進行相关分析。表1显示了PRL基因不同基因型对麦洼牦牛产奶性状的影响。从表1可以看出，经检验分析，2种基因型下牦牛产奶性状存在一些差异，部分指标差异显著（P< 0.05）。具体而言，T碱基缺失后，麦洼牦牛153 d产奶量、乳蛋白质率、乳糖率和乳中的体细胞数均呈降低趋势，但经显著性检验后差异并不显著（P>0.05），特别的，乳脂率在PRL基因998 bp处T碱基缺失后显著升高了（P<0.05），暗示该处T碱基缺失对乳中脂肪含量有显著影响。
3討论
PRL基因与乳脂等泌乳性状极度相关，也是奶牛产奶性状的主要候选基因，但目前对牦牛催乳素基因SNPs的研究还较少。该研究于阿坝州红原县搜集了49个麦洼牦牛的血液样本，并提取DNA和设计引物，再通过直接测序法筛选PRL基因的疑似突变位点，以期找出与麦洼牦牛泌乳性状相关的SNPs。对测序结果分析后发现有29个样本于PRL基因996 bp处T碱基突变缺失，且该位点突变对牦牛产奶性状有显著影响，但目前该种基因型的个体数量较少，因此在后续的研究中有必要进一步扩大样本群体来加以验证。经统计分析，这种T碱基突变型对乳脂的含量有显著影响，因此有可能作为影响麦洼牦牛产奶性状的一个重要候选基因型进行分子遗传标记，进而应用到麦洼牦牛高产奶群的选育工作中。
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