芽孢杆菌菌株GB1作为生物防治剂生产及其对南瓜植物全身抗药性对烟粉虱影响

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　芽孢杆菌 株 菌株 GB1 作为生物防治剂的生产及其对南瓜植物全身抗药性对 烟粉 虱的影响 抽象 害虫是作物生产中的一个巨大问题，造成重大损失。目前，生物防治被用作控制害虫和减少作物生产短缺的环保方法。在目前的研究中，生产一种生物防治剂，其基于测序将 16S rRNA 基因鉴定为 Velezensis 芽孢杆菌 菌株 GB1，GenBank 加入号为。OM836750，在搅拌罐中进行生物反应器采用间歇发酵工艺。这是第一次，B. 将贝氏菌 菌株 GB1 作为生物防治剂进行土壤淋洗试验（10 9 cfu mL −1 ），用于在温室条件下管理 烟粉虱 和诱导南瓜植物全身抗性。24 、 48、72、96 和 120 h 在南瓜叶片中测定 β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶、多酚氧化酶和过氧化物酶活性。B 的影响。velezensis 菌株 GB1 对 B 的种群密度、繁殖力和孵化率 的影响 。研究了南瓜植物上的烟 粉 虱。B. 的分批发酵工艺流程。velezensis 菌株 GB1 使次级代谢物和培养生物量的产量最大化，达到最大值 3.8 g L −1 在 10.5 小时，产率系数为 0.65g 细胞/ g 葡萄糖。用 B 治疗。velezensis 菌株 GB1 诱导南瓜植物提高其 β-1，3-葡聚糖酶，几丁质酶，多酚氧化酶和过氧化物酶的水平。另一方面，B.velezensis 菌株 GB1 可以显著降低南瓜植物上吸引的 烟粉虱 的平均数量。此外，与对照组相比，在接种了 贝氏芽孢杆菌 菌株 GB1 的南瓜植物上，粉虱的平均产卵数为 2.28 枚/雌性/天。在接种 的灰头 螈种中，烟粉虱 卵 孵化率下降 5.7%。

　关键字：

　烟粉虱 ; 芽孢杆菌 ; 生物防治剂; 发酵过程; 发病机制相关（PR ）蛋白; 诱导全身阻力 1. 引言 Bemisia tabaci（Gennadius）（Homoptera：Sternorrhyncha：Aleyrodidae）是观赏植物和园艺作物的主要害虫，在世界各地的田间和温室中。超过 600 种植物已被确定为这种常见害虫的宿主[1]。重度 烟粉虱 感染可导致植物活力下降以及多种生理紊乱[2，3]。此外，若虫的发展通常与烟尘霉菌的形成有关，烟尘霉菌限制了光合作用并导致落叶和发育迟缓[4]。病毒传播可能造成重大损害 ，因为烟粉虱芽孢 杆菌是 100 多种植物病毒的载体[5，6，7]。番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）和黄瓜静脉黄变病毒（CVYV）是两个例子。这些病毒是番茄和黄瓜植株的严重问题，导致产量损失 50%-100%[8，9]。

　化学农药由于其瞬时作用而经常用于管理 烟粉虱芽孢 杆菌，但这种方法具有各种缺点，包括食品安全问题，杀虫剂耐药性，生态危害和非目标生物效应。为了有效控制 烟粉虱 ，已经开发出生物防治剂，作为病虫害综合治理（IPM）系统中传统使用化学农药的替代品[10]。

　诱导植物对食草动物的抗性，这是一种处理植物胁迫条件的新生物学策略，可以作为管理粉虱侵扰的可能方法进行研究[11]。许多研究表明，防御病原体或昆虫攻击的植物防御机制之一是增加次级代谢物或一些宿主蛋白的浓度，其中几种被称为发病机制相关（PR）蛋白。它们目前包括 17 个应激蛋白家族，包括 β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶和过氧化物酶[12，13]。这可以改变营养质量和适口性，提高毒性，并改变宿主植物的解剖结构，物候和生理学。这些化学物质因其在抗性中的可能因果作用而引起人们的兴趣，正如它们在诱导的局部和全身抗性期间的高诱导性所见，通过这些抗性抑制了这些病原体和昆虫的生长和传播。

　在土壤和根际中自由生活的有益细菌被称为促进植物生长根际细菌（PGPR）[14，15]。它增强了植物的生长并诱导了系统性抗性，使植物在未来对各种病原体的攻击更具抵抗力。这种由 PGPR 诱导的长期全身耐药性被称为诱导全身耐药性（ISR）[16，17]，其特征在于形成防御的初始状态，其中防御相关反应在病原体或昆虫攻击反应中更快地引起[18]。据报道，某些 PGPR使用 ISR 来保护植物免受病原体感染[19，20]。然而，PGPR 已经对用于对抗昆虫的 ISR 进行了几种类型的研究[21 ，22，23，24]。

　芽孢杆菌 属经常被用作生物防治剂[9]。它可以改善植物生长，并为各种作物（如黄瓜）提供植物保护[8，15，25]。B. velezensis 是一种广泛分布的需氧，内生孢子形成和革兰氏阳性芽 孢杆菌 物种，由 Ruiz-García 等人命名[26]。它已被广泛研究和使用，因为它对许多植物具有直接或间接的生长促进作用。已观察到 Velezensis 通过次级代谢物的生物合成抑制多种致病真菌的生长，包括 尖孢镰刀菌 [27]， 黄曲霉 [28]，细菌和线虫，通过生物合成二级代谢物，例如 β-1，3-葡聚糖酶，脂肽抗生素

　（表面活性素，伊图林和凤霉素）和铁载体[29，30，31]]，它们在引发植物的系统性抗性方面起着重要作用[32]。然而，其对昆虫攻击的活性以及潜在的细胞和分子防御机制尚未得到广泛阐明[33]。

　本研究的主要目的是在搅拌罐生物反应器中使用批量发酵过程生产 B. velezensis 作为生物控制剂，并通过阐明其潜在机制来评估 B. velezensis 根定植对 B. tabaci 种群密度，雌性繁殖力和温室条件下卵孵化率的影响，以增强表达 与发病机制相关的蛋白质，例如参与建立针对粉虱的防御策略的酶，该策略可以通过综合害虫管理计划使用。

　2. 材料和方法 2.1. 烟粉虱杆菌的实验室培养

　B. 的成人。

　烟粉虱 （Gennadius）（目：同翅目，亚目：Sternorrhyncha，科：Aleyrodidae）在健康的番茄植物 （ Lycopersicon esculentum Miller）上饲养。粉虱的母殖民地由 El-Helaly 教授建立，自 20 世纪 60 年代以来一直在亚历山大大学农学院应用昆虫学系饲养。最近，英国自然历史博物馆昆虫学系昆虫/植物司的 Jon Martin 博士重新确定了粉虱的母体殖民地。

　细菌分离物的分离和分子鉴定

　本研究中用作生物防治剂的细菌分离物由埃及科学研究和技术应用市（SRTA-City）基因工程和生物技术研究所（GEBRI）生物过程开发部 Abo-Zaid 博士（亚历山大 - 埃及）从茄子根的根际（亚历山大 - 埃及）中分离出来。

　根据 Istock 等人的说法，从当前研究中分离出的拮抗细菌分离株中提取总 DNA[34]。通用引物，开始（正向）5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3"和结束（反向）5′TACGGYACCTTGTTACGACTT 3"用于扩增 16S rRNA 基因的整个长度[35]。利用大染料终止子测序试剂盒，基于酶链终止子方法纯化并测序拮抗细菌分离物的扩增 16S rRNA 基因。然后将核苷酸序列与 GenBank 数据库）中的其他 16S rRNA 基因序列进行比较（于 2022 年 3 月 2 日访问）。系统发育树是使用 MEGA 软件版本 5（SRTA-City）中的邻居连接方法构建的，总共有 2000 个自举复制。

　细菌分离物的生产

　2.3.1. 搅拌罐生物反应器的制备 批量发酵在 10 升台式生物反应器（美国纽约州萨拉托加的克利弗）中进行，该反应器配有三个六叶片盘式涡轮叶轮叶轮和四个挡板，并由工作容积为 4 L 的数字控制单元控制。该过程使用具有 10.4 英寸彩色触摸屏界面的控制单元实现自动化，并能够针对各种情况存储多达 59，994 个不同的程序。温度和 pH 值分别在 30°C 和 7 处建立。自动喂料 2 mol L −1 氢氧化氢和 2 摩尔 L −1 HCl 控制 pH 值。空气被压缩并在通过无菌过滤器后调节至 1 VVM（每分钟每个肉汤体积的空气量）。通过在200 和 600 rpm 之间改变搅拌速度，溶解氧水平保持在 20%以上。使用梅特勒-托利多电极在线测定溶解氧水平和 pH 值。

　2.3.2. 批量发酵过程 通过将分离物的单个菌落接种到含有 100 mL 3 号生产培养基的 500 mL 锥形瓶中来预培养细菌分离物[36]。将细菌分离物在 30°C 下生长过夜，并在 200rpm 下下下固定。使用 3 号生产介质和光密度（O.D）在生物反应器中启动细菌分离物的批量发酵过程 550 ）

　的 0.5。在整个发酵期间采集了几种培养样品，并使用 550nm 处的光密度作为细胞数量的指标。

　生物质估算 使用 10mL 培养液样品测定干细胞重量，将其以 894×g 离心 10 分钟，并且重悬，洗涤并像以前一样再次离心沉淀。之后，在 80°C 的干燥空气烘箱中对颗粒进行干燥过夜[37]。

　葡萄糖的估计 酶比色试剂盒（埃及钻石诊断）用于测量葡萄糖浓度，其基于葡萄糖氧化酶活性和过氧化物酶活性。最终产物是红紫色醌亚胺染料，用作葡萄糖浓度的指示剂。

　南瓜植物发病机制相关（ PR ）蛋白的诱导

　2.4.1. 实验设计 C 的种子。

　将 pepo 浸泡在水中 2 天以同步发芽，然后将其单独播种在花盆（直径 15 厘米）中，并加入一公斤含有粘土，沙子和泥炭藓的混合土壤（1：1：1）。当它们达到四片膨胀叶子的发育阶段时，它们被分成四组。每 15 株植物代表一种处理。第一组代表对照植物，第二组在每个盆中在根际上浸入 10 mL 细菌培养液（10 9 cfu mL −1 ).其他两组南瓜植株用玻璃灯笼覆盖，第三组单独暴露于 50 个年龄或性别不明的 烟粉虱 成虫，而第四组分别以与第二组和第三组相同的速率暴露于细菌培养液和烟粉虱 。治疗进行 24，48，72，96 和 120 小时。所有组均在 25±5°C，65±5 RH 和自然光照条件下的防虫温室中饲养。

　2.4.2. 用于测定酶活性的样品提取 从四个处理组的所有植物中收集一克叶样，并在 0.3 克聚乙烯吡咯烷酮（PVP，也称为聚维酮或聚维酮）存在下，用预冷的研钵和研杵在 10mL 0.05 M 乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中压碎。最后，将样品在 4°C 下以 16，000×g 离心 15 分钟。

　使用上清液作为 cruds 酶测定 β-1，3-葡聚糖酶，几丁质酶，多酚氧化酶和过氧化物酶的活性。

　2.4.3. β-1 ，3- 葡聚糖酶活性的测定 Saikia 等人对 β-1，3-葡聚糖酶活性进行比色测定[38]。反应混合物由 62.5μL0.04%层粘连蛋白和 62.5μL 酶提取物组成。反应的温度和保温时间分别为 40°C，持续 10 分钟。通过加入 375μL 二硝基水杨酸并在沸水浴中加热 5 分钟来停止反应，并使用涡旋摇动 Eppendorf 管并在 500nm 处测量其吸光度。酶活性以 Ug 表示 −1 新鲜重量（在实验条件下每分钟释放一 μM 葡萄糖的酶量）。

　2.4.4. 几丁质酶活性的测定 将一 mL 酶提取物加入到 0.05M 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液（pH 6.6）中的 1mL 胶体甲壳素中，并通过在试管中振荡混合，然后在 37°C 的水浴中保持 75 分钟并摇动。然后通过加入 1mL 二硝基水杨酸[39]并加热 5 分钟，然后冷却并以 3000×g 离心 5分钟以除去甲壳素，然后在 540nm 处测量外径。几丁质酶活性被定义为 Ug −1 新鲜重量（在实验条件下每分钟释放的 μM N-乙酰葡糖胺）。

　多酚氧化酶活性的测定 根据 Mayer 等人测定多酚氧化酶活性[40]。将 200μL 酶提取物加入到 1.5mL 的 0.1M 磷酸盐缓冲液（pH 7）中。为了开始反应，在磷酸盐缓冲液（pH 7）中加入 200μL0.01M 儿茶酚，活性在 495nm 处表达为吸光度的变化 −1 . 过氧化物酶活性的测定 反应混合物由 0.5 mL 酶提取物和 0.5 mL 1% H 组成 2 O 2 .将 1.5 mL 0.05 mL 邻苯三酚分别加入到每个样品中并在室温下孵育。酶活性表示为 420nm 处吸光度的变化，间隔 1 分钟[41]。

　细菌分离株对烟粉虱菌种群密度的影响

　为了研究细菌分离株对烟 粉虱 成虫吸引力的影响，研究了与酶测定实验设计中相同的发芽，栽培，花盆直径，土壤重量和发育阶段的植物。在相同条件下，将植物在温室中分为两组，每组由五株植物组成。第一组是仅用水淋湿的对照组，第二组用10mL 细菌培养液浸泡（10 9 cfu mL −1 ）在每个花盆的根际上。从母体殖民地收集粉虱成虫，并在自由选择测试中释放在温室的中心。对于每次治疗，吸引的粉虱数量/厘米 2 /plant 以每日记录和计算为每日记录的平均值。为了避免粉虱的移动，计数是在清晨轻轻地完成的。该实验连续五天被复制。获得的数据计算为五个副本的平均值。

　细菌 分离株接种南瓜植物对烟粉虱产卵和孵化率的影响

　为了研究细菌分离株对粉虱雌性产卵吸引力和卵孵化率的影响，5 种植物接种细菌培养液（10 9 cfu mL −1 ）和未接种的植物（对照）被玻璃灯笼覆盖，并用 烟粉虱 的自然性别比例（2 雄性：3 雌性）侵扰四天，以允许产卵。通过摇晃植物去除成虫

　后，记录下产的卵/植物并计算为五个复制品的平均值。植物被转移到防虫温室。为了使植物免受新 竹蕊 成虫的侵扰，每株植物被玻璃灯笼完全覆盖，直到鸡蛋出现，然后记录孵化率的百分比并计算为五个复制品的平均值。

　统计分析

　使用 SAS 软件[42]使用随机完全阻塞设计（RCBD）分析获得的结果（双向方差分析）。根据 概率 p≤0.05 水平下的最小显着差异（LSD）确定处理间的显着差异。

　3. 结果 细菌分离物的分子鉴定

　当前研究中使用的细菌分离物是根据 16S rRNA 的测序鉴定的。在国家生物技术信息中心网站）的 BLAST 搜索中，在数据库中进行了检索以鉴定细菌分离株（2022 年 3 月 2 日访问）。研究表明，所研究的细菌分离株的序列几乎与几种 B. velezensis菌株相似，同源性百分比为 99%。PGPR 分离株鉴定为 贝勒氏芽孢杆菌 菌株 GB1，加入号 OM836750。使用当前研究中获得的B. velezensis 菌株 GB1 的 16S rRNA 基因的核苷酸序列和从 GenBank 数据库）获得的其他芽孢杆菌物种的 16S rRNA 的核苷酸序列（2022 年 3 月 2 日访问）建立了系统发育树。系统发育树揭示了存在两个主要簇。第 1 组包括 大肠杆菌 ，而本研究获得的 贝氏芽孢杆菌 菌株 GB1 和 GenBank 提供的所有 芽孢杆菌 属菌株均聚集成在 2 组，分为两组。第一组包括 B。

　淀粉纤维 ，B.枯草枯草 和 枯草杆菌 。GenBank 提供的 地衣样 ，而第二组含有本研究中分离的 B. velezensis 菌株 GB1，并且从 GenBank 收集的所有 B. velezensis 菌株具有很高的一致性百分比，达到 95%（图 图 1）。

　图 图 1.本研究获得的 velezensis 芽孢杆菌 菌株 GB1 的系统发育树，并根据 16S rRNA 基因的核苷酸序列有效地描述了 芽孢杆菌属的成员。系统发育树是使用 MEGA 版本 5 的邻接方法构建的。

　3.2. 贝氏芽孢杆菌菌株的生产...