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正文查重【优秀范文】

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正文查重【优秀范文】

 

 摘要:

 目的

 建立兔子体内不同组织中利福平分析方法建立及含量测定。研究兔子腰椎皮下埋植给药方式的情况下,三种药物(原料药、处方 6、处方 9)在兔子体内肝脏、兔肺脏部位、兔脾脏部位的利福平浓度和回收率和精密度。

 方法

 以THERMAL BDS C 18

 column (5µm, 250 mm×4.6 mm)为色谱柱,流动相为乙腈-甲醇-0.01mol/l 磷酸二氢钾-1mol/l 柠檬酸=40:30:26:4(v/v);流速 1.0 mL/min,柱温 35℃,紫外检测波长 333nm,进样量 20μL。36 只实验用大白兔随机进入实验组,实验组分为 A、B、C 三组,A 组为腰椎皮下埋植原料药,B 组为腰椎皮下埋植处方 6,C 组为腰椎皮下埋植处方 9。用高效液相色谱法检测各天数后的血浆药物浓度、腰大肌部位药物浓度、腰椎体部位药物浓度。

 结果

 利福平在0.01-5.0µg/mL 的肝脏浓度范围内线性关系良好(r=0.9999),回收率达 85%以上,日内变异系数均小于 10%;利福平在 0.05-10.0 µg/mL 的肺脏部位和脾脏部位浓度范围内线性关系良好(前者 r=0.9999,后者 r=0.9995),前者回收率达 88%以上,日内日间变异系数均小于 10%;后者回收率达 85%以上,日内日间变异系数均小于 10%。对于血浆中利福平的浓度基本检测不到,腰大肌和腰椎体都有利福平的蓄积。

 结论

 本研究建立了一种兔子肝脏、肺脏和脾脏组织中利福平简便、快速、灵敏准确的高效液相色谱(HPLC)检测方法,并将该方法应用在利福平在家兔体内的药物动力学研究。

 关键词

 利福平

 兔肝脏

 兔肺脏

 兔脾脏

 高效液相色谱法

  Abstract: Objective

 establish methods rabbits rifampicin different organizations and assaying. Case study of rabbit lumbar implants administration of three drugs (bulk drugs, prescription 6, prescription 9) in vivo rabbit liver, rabbit lung area, rabbit spleen parts of rifampicin concentration and recovery and precision. Methods THERMAL BDS C18 column (5μm, 250 mm × 4.6 mm) for the column with a mobile phase of acetonitrile - methanol -0.01mol / l potassium dihydrogen phosphate -1mol / l of citric acid = 40: 30: 26: 4 (v / v); the flow rate of 1.0 mL / min, the column temperature was 35 ℃, detection wavelength 333nm, the injection volume was 20μL. 36 experimental rabbits were randomly assigned to the experimental group, the experimental group was divided into A, B, C three groups, A group of lumbar implants API, group B prescription 6 lumbar implants, Group C lumbar implants Prescription 9. Plasma drug concentration after a few days each by high performance liquid chromatography, psoas site drug concentration, drug concentration lumbar portion. Results rifampicin concentrations in the liver linear relationship 0.01-5.0μg / mL of good (r = 0.9999), the recovery rate of 85%. Within less than 10% coefficient of variation; rifampicin 0.05-10.0 μg / mL site location and spleen lung concentration range a good linear relationship (former r = 0.9999, which is r = 0.9995), the former recovery rate of 88%, intraday day coefficients of variation were less than 10%; the latter recovery rate of 85% above intra-day variations were less than 10%. The concentration in plasma rifampicin substantially less than the psoas muscle and lumbar rifampicin has accumulated. Conclusion This study established a rabbit liver, lung and spleen tissues rifampicin is simple, rapid, sensitive and accurate high performance liquid chromatography (HPLC) detection method, and the method used in the drug rifampicin in rabbits Kinetics.

  Keywords :

 rifampicin ; liver ; lung ; spleen ;

 HPLC

  1 引言 结核病是目前感染性疾病中的一号杀手,1992 年世界卫生组织正式结核病进入了“全球紧急状态”[1] 。目前全世界约有三分之一的人口感染结核菌,1.7亿人感染结核病,感染和发病比率约为十分之一,每年死亡人口将近三百万。高的治疗费用,低的治愈率,高的死亡率等等因素,都可以得出得了结核病后这方面的不好之处。对于患者自身而言,除了健康受到损害,生命质量受到影响等等外,其他精神反面也受到了很大的打压。对于患者的家庭,他们的精神与经济两方面都会受到沉重的压力影响,从而使该方面的社会负担问题加重。现关于结核病方面的已成为全球性的严峻难题,我国是这一方面的重灾区,仅次于印度。随着人们生活水平的提高,对自身健康的关注也随之提高。所以人们对抗结核病方面的措施做了很多,改善了很多。世界各国结核病的发病率和死亡率曾因卫生状况的改善和抗结核病药物的不断发展大幅度的下降。但是,由于耐药问题方面的突出,艾滋病的流行使其与结核分枝杆菌的双重感染,再加上有些贫困地区人口的剧增等诸多方面的原因,使得结核病疫情再度恶化,控制方面变得更难。因此,在如今提倡高质量生活减少疾病的现代化社会加大对抗结核病药物的研究是至关重要的。

 自从 1944 年链霉素被发现以来,异烟肼、利福平等抗结核药物相继问世。根据其抗菌能力强弱,可将现今的抗结核药物依次分为:①具备抑菌作用的抗结核药物:环丝氨酸(CS)、乙胺丁醇(EMB)、对氨基水杨酸(PAS);②具备杀菌作用的抗结核药物:利福平(利福平)、异烟肼(INH)、吡嗪酰胺(PZA)、卷曲霉素(KM)、卡拉霉素(CPM)、链霉素(SM);具备一定杀菌能力的抗结核药物:氧氟沙星(OFLX)、左氧氟沙星(LVFX)等。临床上将利福平、异烟肼、链霉素等定义为一线抗痨药。剩余的皆为二线抗痨药。1978 年的全国结核病会议上,提出了“早期、规律、全程、适量、联用”的结核病治疗基本准则。[2,3]

 抗结核药物的开发过程十分漫长,从被发现到应用于临床一般需要 10 年左右的时间,花费将近 10 亿美元。据统计,在利福平问世之后的 30 年间,被批准上市的新药有 1200 多种,但这其中没有一种用于抗结核的药物。一部分原因是

 因为抗结核药物开发起来较其他抗生素相对困难,另一部分原因是因为结核病大都发生在发展中国家和贫困国家,制药工业的积极性不足与临床需要不成比例是其重要原因之一。我们可以预见在临时使用上还将会有较长的一段时间缺少新型强有力的抗结核药物。传统的抗结核药物(如利福平)的给药方式存在以下缺点:①给药时间长,现有的抗结核治疗方案均为长期型,时间要求均要 6-9 个月以上,部分治疗方案则要求 12-18 个月以上;②药物在体内的作用时间短,需经常服药,在病灶内能否达到有效的杀菌抑菌浓度还存在争议;③长期服用会对肝、肾功能发生损伤,引起并发症;④治疗周期长,病人依从性差,易产生耐药性。二十世纪八十年代以来,科学家们对抗结核药物的载体以及缓释技术的研究从未停止,有望弥补以上的不足。[6]

 肝脏毒性是利福平的主要不良反应,利福平和异烟肼合用还会明显增加肝毒性,甚至出现致命的急性肝坏死和肝功能衰竭。已有研究资料表明,利福平易导致发生变态反应,可致黄疸和肝细胞坏死,还可直接引起脂质过氧化致肝脏损伤,并且作为肝微粒体酶的诱导剂,其与异烟肼联合应用时可刺激微粒体酶加速乙酰肼合成,从而使肝损伤加重,但目前还缺乏利福平毒性作用机制的深入研究。[7]

 利福平的分析方法的研究,改进也是必不可少的。综合文献,利福平的分析方法也有很多,如分光光度法,化学发光法,高效液相色谱法等。在大部分文献报道中,利福平的高效液相色谱方法含量测定技术已经较为成熟。本研究对兔子脊柱皮下埋植给药后血清中利福平体内高效液相色谱方法含量测定进行研究,并建立快速、简便、灵敏准确的高效液相色谱检测方法。

 2 材料与方法 2.1 实验用试剂、药品、仪器及动物 2.1.1 试剂

 乙腈(色谱纯),杭州市米克化工仪器有限公司;甲醇(色谱纯),杭州市米克化工仪器有限公司;磷酸二氢钾(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;柠檬酸(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;乙酸乙酯(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;三氯乙酸(分析纯),杭州高晶精细化工有限公司;二氯甲烷(分析纯),杭州高晶精细化工有限公司;正己烷(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;水(本实验用到的水均为超纯水);速眠新注射液;氯胺酮注射液

 2.1.2 药品

 利福平标准品(中国药品生物制品检定所);利福平原料药(客户提供);处方6(客户提供);处方 9(客户提供);

  2.1.3 仪器

 shimadzu 20AT 高效液相色谱系统(日本岛津);色谱柱为 THERMAL BDS C 18

 column (5µm, 250 mm×4.6 mm);浙江大学智达 N2000 色谱工作站;Hettich Mikro 22R 超高速低温离心机(德国);YKH-型涡旋混合器(上海精科实业有限公司);BS200S-WEI 电子天平;KQ-25OB 型超声波仪(昆山超声仪器有限公司);氮吹仪(上海极恒实业有限公司);WMZK-01 恒温水浴锅;抽滤装置(上海富雪生物科技有限公司);SHBZ- III A 型循环水真空泵;0.45µm 微孔滤膜(上海新亚净化器件厂);

 10ml 具塞离心管,1.5ml 小离心管,尖底玻璃离心管;试管架;量筒;Thmermo微量移液枪;匀浆器;玻璃棒;烧杯;实验用兔笼;实验用剪骨器;实验用手术板;动物用手术装置 2.1.4 实验动物

 实验用大白兔(由浙江省实验动物中心提供),体重 2.2kg~2.5kg/只,雌雄兼用。

  2.2 试验方法

 2.2.1 实验动物分组与给药

 取实验用大白兔 46 只,体重 2.2-2.5kg/只,雌雄不限,分笼饲养。随机取1 只用于空白方法组,其余 45 只随机进入实验组。实验组共分为 A、B、C 三组,每组 15 只。A 组为腰椎皮下埋植原料药,B 组为腰椎皮下埋植处方 6,C 组为腰椎皮下埋植处方 9。各组兔称重后,将实验兔左侧腰背部去毛备皮,常规皮肤消毒,右侧卧固定在手术板上,用速眠新麻醉 0.5ml/kg+氯胺酮 0.1ml/kg 麻醉,等麻醉起效后,切开浅层肌肉,沿腰椎植入 A、B、C 组药物,消毒,缝合,包扎固定。后将兔子按 1d、7d、14d、28d、56d 分笼饲养。术后饲养,观察及检测:定期观察动物活动及进食情况,伤口愈合情况。饲养要保证兔子存活,环境符合,无影响实验情况发生。

 在各天数到后,进行耳缘静脉取血,在最后时间点还未到时,需要取血,不得处死,要使兔子存活。在取完血,要取组织时,处死,后取腰大肌,腰椎骨进行检测。

 对于空白组的处理:在适当的时候取血,取腰大肌,腰椎骨。除了不植入药

 物,其它都同实验组。

 2.2.2 样品处理

 2.2.2.1 兔 肝脏 的样品与处理

 ①肝脏组织匀浆液的制备:将肝脏组织用镊子取出,而后剪碎细微,搅拌,取其重量与水体积比例为 1:1 适量于匀浆器匀浆均匀,易被移液枪准确取出即可。

 ②准确吸取上述 0.6ml 肝脏组织匀浆液于 10ml 具塞离心管中,振荡混匀,后向其中准确加入乙酸乙酯 3ml,涡旋振荡器漩涡 5min,在 6000r/min 转速的条件下高速离心 5min 后,取出全部上层有机相于尖底玻璃离心管中;向萃取完第一次后的 10ml 具塞离心管中加入 2ml 乙酸乙酯重复萃取一次。后合并两次萃取的有机相于尖底玻璃离心管中,在 45℃水浴中用氮气流吹干装有有机相的尖底玻璃离心管。后留在尖底玻璃离心管中的残渣用 0.2ml 流动相复溶,涡旋振荡器漩涡混匀 1min,再将其放入试管架中,将此带有处理过的尖底玻璃离心管放入超声仪中超声 15min,使尖底玻璃离心管中的残渣与流动相充分混匀。后将其移入 1.5ml 的小离心管中,后在其加入 0.2ml 正己烷取出脂肪,于涡旋振荡器漩涡1min,将小离心管置于离心机,在 18000r/min 转速的条件下高速离心 5min 后,吸取上清液 20µl 进高效液相色谱系统分析。

  2.2.2.2 兔 肺脏 组织的样品与处理

 ①肺脏组织匀浆液的制备:将肺脏组织用镊子取出,而后剪碎细微,搅拌,取其重量与水体积比例为 1:1 适量于匀浆器匀浆均匀,易被移液枪准确取出即可。

 ②准确吸取上述 0.6ml 肺脏组织匀浆液于 10ml 具塞离心管中,振荡混匀,后向其中准确加入乙酸乙酯 3ml,涡旋振荡器漩涡 5min,在 6000r/min 转速的条件下高速离心 5min 后,取出全部上层有机相于尖底玻璃离心管中;向萃取完第一次后的 10ml 具塞离心管中加入 2ml 乙酸乙酯重复萃取一次。后合并两次萃取的有机相于尖底玻璃离心管中,在 45℃水浴中用氮气流吹干装有有机相的尖底玻璃离心管。后留在尖底玻璃离心管中的残渣用 0.2ml 流动相复溶,涡旋振荡器漩涡混匀 1min,再将其放入试管架中,将此带有处理过的尖底玻璃离心管放入超声仪中超声 15min,使尖底玻璃离心管中的残渣与流动相充分混匀。后将其移入 1.5ml 的小离心管中,后在其加入 0.2ml 正己烷取出脂肪,于涡旋振荡器漩涡1min,将小离心管置于离心机,在 18000r/min 转速的条件下高速离心 5min 后,吸取上清液 20µl 进高效液相色谱系统分析。

 2.2.2.3 兔 脾脏 组织的样品与处理

 ①脾脏组织匀浆液的制备:将脾脏组织用镊子取出,而后剪碎细微,搅拌,取其重量与水体积比例为 1:1 适量于匀浆器匀浆均匀,易被移液枪准确取出即可。

 ②准确吸取上述 0.6ml 脾脏组织匀浆液于 10ml 具塞离心管中,振荡混匀,后向其中准确加入乙酸乙酯 3ml,涡旋振荡器漩涡 5min,在 6000r/min 转速的条件下高速离心 5min 后,取出全部上层有机相于尖底玻璃离心管中;向萃取完第一次后的 10ml 具塞离...

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